ADN et Chimie Médico-Légale    

  Dr. Lhoëst G.J.J.

1. Introduction

L' ADN ou acide désoxyribonucléique est le matériel présent dans toute cellule de l'organisme et assure en quelque sorte le transfert d'un trait commun d'une génération à une autre.  Bien que la majorité du génome humain représentant l'ensemble des groupes de gènes d'un individu soit le même au travers de différents groupes ethniques, des individus diffèrent légèrement dans leur constitution génétique et ainsi présente un profil ADN unique correspondant à certaine séquence bien particulière.   La détermination du profil ADN typique se  fait grâce à une analyse génétique moléculaire qui identifie des motifs ADN unique.  En analyse médico-légale l'établissement du profil ADN est utilisé pour identifier les personnes qui ont commis un crime.  On peut estimer que plus ou moins 1 % de l'ensemble des affaires criminelles sont résolues en faisant appel à cette technique.  Le profil ADN a également été utilisé pour acquitter plusieurs suspects pouvant être impliqué dans des cas de meurtre ou pour aider des enquêteurs à résoudre des cas de crimes violents non résolus dans le passé.   Le système judiciaire peut égaleutilment demander l'établissement d'un profil ADN pour trancher un problème de revendication d'une paternité ou pour résoudre des problèmes liés à des cas d'immigration.

L'analyse moléculaire ADN a aussi été utilisée dans l'établissement d'un diagnostic de désordre clinique.  De nombreuses maladies génétiques sont provoquées par des mutations de l'ADN dans des régions du génome qui codent pour la synthèse protéique et des analystes examinent ces régions afin de repérer des mutations à la source de maladies génétiques.  A la différence de la génétique clinique moléculaire,  l'établissement d'un profil ADN en chimie médico-légale tire profit de loci dans le génome humain qui ne code pas pour des protéines.  Ces loci font intervenir des séquences d'ADN répétitives qui sont polymorphes ou qui ont un nombre variable de grandeurs répétitives.  En raison du fait que des régions non-codantes pour les protéines sont utilisées, les banques de données ADN qui contiennent des informations de profils ADN typiques ne révèlent pas informations liées à la santé d'un individu ou à la présence de maladies génétiques éventuelles.

2. Structure de l'ADN

L'ADN se  compose d'une longue chaîne linéaire de désoxyribonucléotides composée de plusieurs centaines de millions de ces élements pouvant être enchaînés les uns aux autres au sein d'un seul polynucléotide qui est  ensuite compacté pour en faire un chromosome.   Trois éléments essentiels sont refermés dans un nucléotide à savoir la base, le désoxyribose et le résidu phosphate.  Les bases puriques comme l'adénine et la guanine ou les bases pyrimidiques commen la thymine et la cytosine sont reliées par une liaison N-glycosidique à l'atome C1' d'un 2'-desoxyribose comme illustré dans la figure ci-dessous à droite.  L'élement formé d'une base et d'un 2'désoxyribose est appelé nucléoside.  Un nucléotide est formé lorsqu'un radical phosphate estérifie le groupement hydroxyle du C5' du sucre. 

                           

   Un polynucléotide se forme à partir de fonctions phosphodiesters reliant le groupe hydroxyle de l'atome C3' d'un premier nucléotide à la postion C5' d'un  deuxième nucléotide.  Par définition, la chaîne est orientée de la position 5' vers la postion 3'.  Les positions 5' et 3' terminales ne sont pas reliées à des fonctions phosphodiesters (voir figure ci-dessus à droite).  Il est à remarquer que la synthèse de l'ADN dans la cellule se fait dans la direction 5'-3', les nucléotides étant ajoutés à l'extrémité 3' d'un brin d'acide nucléique préexixtant.

Double Hélice

Quatre nucléotides différents et un ADN de n résidus permet à ce dernier d'adopter 4n sésuences différentes. La structure de l'ADN en double hélice est constituée par deux brins nucléotidiques arrangés en sens inverse de manière antiparallèle et s'enroulant en hélice autour d'un axe commun si bien qu'une double hélice est formée.  Les résidus désoxyriboses phosphates forment la couche externe de la double hélice et les bases nucléotidiques comme l'adénine (A), la cytosine (C), la guanine (G), la thymine (T) assurent les intéractions internes de la double hélice par appariement des bases entre brin opposé A-T et G-C formant ainsi des paires de bases complémentaires définies également comme les paires de base Watson-Crick s'adaptant par des ponts d'hydrogène. 

                                                    

En raison de la complémentarité des bases entre les deux brins, le type de base appariée reste toujours le même A-T et G-C mais les proportions relatives de ces mêmes bases peuvent variées entre molécules d'ADN.  Comme illustré dans la figure ci-dessus à droite, A-T deux liaisons d'hydrogène assurent l'appariement alors que ce dernier est assuré par trois liaisons d'hydrogène pour G-C.   Ces appariements spécifiques de bases engendrent des forces différents ayant des implications sur la stabilité de l'hélice.  Les hélices d'ADN peuvent adopter différentes conformations et deux sens de rotation et c'est l'hélice B qui est prédominante dans la nature.

 

3.  Fonction de l'ADN

L'alphabet composé de quatre lettre A,T,G et C qui peut être utilisé dans n'importe quel ordre définit le rôle et la fonction de la molécule d'ADN.  L'ADN a la propriété de pouvoir contrôler la synthèse de molécules complexes appelées protéines qui sont constituées par un enchaînement d'acides aminés.  Des milliers de protéines existent mais elles dérivent de la combinaison de 20 acides aminés dont la séquence dans la chaîne protéinique détermine la forme et la fonction de la protéine.                                                                                                                                                                                         Hémoglobine humaine

1GZX Haemoglobin.png

 

 

 

Par example l'hémoglobine est présente dans nos globules rouges et cette dernière transporte l'oxygène dans les cellules de notre corps et en élimine le dioxyde de carbone.  Un enchaînement d'acides aminés répertorié ci-dessous se retrouve dans une des chaînes protéiniques de l'hémoglobine. 

   Valine-histidine-leucine-thréonine-proline-glutamate-glutamate    

  Valine-histidine-leucine-thréonine-proline-Valine-glutamate

Lorsque dans cet enchaînement d'acides aminés un glutamate est remplacé par une valine, une hémoglobine anormale est obtenue conduisant à une drépanocytose ou anémie falciforme (sickle-cell anaemia).  L'ADN renferme l'information génétique qui va déterminer la séquence des acides aminés pour toutes les protèines fabriquées dans notre organisme.  Cette information qui est stockée le long de brins d'ADN est un code génétique basé sur la séquence des bases le long des brins d'ADN.  L'alphabet de ce code est simple et se rapporte aux bases A,T, G, et C et l'enchaînement de trois bases symbolisée par trois lettres correspond à un acide aminé en particulier.   Par example l'enchaînement C-G-T correspond à l'alanine, C-T-A à l'aspartate et A-A-A à la phenylalanine. 

Un segment d'ADN correspondant à    -C-G-T-C-T-A-A-A-A-C-G-T-  correspond à l'enchaînement des acides aminés suivant en appliquent ce code en triplet:

               C-G-T------C-T-A-------A-A-A--------C-G-T----------

              Alanine                 aspartate             phenylalanine            alanine

La seule différence entre l'hémoglobine normale et l'hémoglobine conduisant à l'anémie falciforme correspondant aux enchaînements normaux et abnormaux suivants:

                                                  -C-C-T----------G-A-G---------G-A-G--------

                                                  proline----------glutamate------glutamate----

                                                -C-C-T----------G-T-G------------G-A-G------

                                                 proline----------valine------------glutamate

La modification d'une seule base (A du glutamate est remplacé par T dans la valine) conduit à la drépanocytose si bien que l'équilibre entre santé et maladie peut dépendre de la présence ou de l'absence d'une seule base.

 

4.  Hémoglobine Q et Spectrométrie de Masse

La spectrométrie de masse peut être utilisée pour établir la constitution chimique de chaînes polypeptidiques de l’hémoglobine pour des échantillons cliniques inhabituels.  Des informations se rapportant aux chaînes polypeptidiques individuelles a et b de l’hémoglobine peuvent être obtenues et la détection de mutants peut être envisagée.  L’hémoglobine HbQ détectée surtout en Inde a été identifiée comme une mutation a 64D ----H .   Pour arriver à ces conclusions des spectres MALDI-MS/MS après digestion enzymatique à la trypsine ont été comparés pour une hémoglobine normale et pour une hémoglobine HbQ (voir spectres ci-dessous

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Les ions quasi-moléculaires (M + H)+ sont observés respectivement à 2997,3 et 3019,3 soit une différence de masse de 22 Da.  Le tableau ci-dessous permet de conclure à une substitution d'un aspartate par une histidine.

 

L'obtention de la séquence des acides aminés obtenue en MALDI-MS/MS du fragment peptidique après digestion par la trypsine et correspondant aux enchaînements 62-90 de la globine a, a pu permettre la localisation du site de mutation comme

 a64D---H.

 

 

 

                                                                                                                                                                       Structure spatiale de l'Hémoglobine

 

 

5. Réplication de l'ADN

La réplication de l'ADN implique la production d'une copie identique d'une double hélice si bien que deux brins complémentaires doivent d'abord être séparés.  Un brin est ensuite utilisé comme modèle à la synthèse d'un brin complémentaire qui se fait par le truchement des ADN polymérases   Les désoxyribonucléosides triphosphates sont ajoutés un par un par ces enzymes à un nouveau polymère d'ADN. 

C'est l'élongation de la chaîne qui est privilégiée étant donné qu'une pyrophosphatase clive le pyrophosphate en deux phosphates inorganiques.   La phase de synthèse S qui est observée aussi bien chez les procaryotes que ches les eucaryotes a lieu à partir des brins parentaux et deux brins fils sont nouvellement synthétisés.  Cette réplication se passe de façon semi-conservative ainsi que démontré dans l'expérience de Meselson et Stahl (voir figure ci-dessous

          

                                                                                                   ADN  14N/14N     ADN 14N/15N    ADN 15N/15N

 

A la première génération, les deux doubles hélices nouvellement synthétisées sont constituées d'un brin parental et d'un brin fils.  La machinerie élémentaire de réplication de l'ADN dépend de la complémentarité des molécules d'ADN et de la capacité de certaines protéines à établir des interactions spécifiques avec des séquences particulières de l'ADN.   Les enzymes principaux suivants participent à la réplication:     

a)  les ADN polymérases

b)  les primases

c) les ligases

d) les hélicases

e) les topo-isomérases

f) les télomérases (eucaryotes)

 

L'enzyme qui catalyse la polymérisation des nucléotides s'appelle l'ADN polymérase.  Cette enzyme ajoute des désoxyribonucléotides à l'extrémité 3' d'une chaîne nucléotidique en cours d'élongation en utilisant une matrice d'ADN simple brin.  Les substrats de l'ADN polymérase sont les formes triphosphatées des désoxynucléotides à savoir dATP, dGTP, dCTP et dTTP.  Les ADN polymérases lisent exclusivement dan le sens 3'---5' et synthétisent donc le nouveau brin d'ADN dans le sens 5'------3' .  Contrairement à l'ARN polymérase, l'ADN polymérase ne peut pas enchaîner des nucléotides libres, une amorce (primer) ARN ou ADN est nécessaire. Des enzymes du type des primases synthétisent un court fragment d'ARN renfermant de 3 à 10 ribonucléotides et sont des ARN polymérases spécialisées.  L'ADN polymérase de type 3 peut alors ajouter d'autres nucléotides à l'extrémité 3'-OH libre de l'amorce et cette dernière est éliminée à une étape ultérieure de la réplication.  Le démarrage de la réplication commence par l'ouverture de la double hélice d'ADN et sont des protéines de liaison à l'ADN double brin (DnaA) qui se fixent à un segment déterminé à l'origine de la réplication en incurvant l'ADN si bien que la double hélice s'ouvre sur une région d'environ 12 paires de bases.  Des protéines SSB (single strand binding proteins) peuvent dès lors se fixer et stabiliser la portion de l'ADN double brin partiellement ouvert et ainsi permettre à l'hélicase de poursuivre l'ouverture du double brin.  L'hélicase est une enzyme capable de se fixer et de cliver l'ATP si bien que l'énergie libérée lors de l'hydrolyse peut être convertie en travail mécanique de séparation progressive des deux brins.  Des protéines SSB stabilisent les brins dissociés qui en raison de leur complémentarité ont tendance à se réunir.  Cette stabilisation n'est que ponctuelle en laissant la possibilité aux bases d'interagir avec un nucléotide complémentaire.  Les brins d'ADN dissociés forment une fourche de réplication (voir figures).  Le long des brins d'ADN dissociés, les primases synthétisent une amorce d'ARN en suivant les instructions liées aux brins dans le sens 5'---3'.  L'amorce synthétisée, les ADN polymérases du type 3 s'aasocient au complexe et allongent les amorces.  Il est à remarquer que les deux simples brins qui servent de matrices sont antiparallèles (direction 5'--3' et 3'---5' respectivement).  Comme les ADN polymérases lisent seulement dans le sens 3'--5' et synthétisent donc dans le sens 5'--3', ces derniers doivent travailler différemment sur les deux brins de matrice.  Un brin précoce peut être synthétisé le long de la matrice 3'--5' en direction de la fourche de réplication, le sens de la synthèse et l'orientation de la matrice coincident si bien que l'action de l'hélicase est suivie par celle de la polymérase et une seule amorce d'ARN est seulement nécessaire pour assurer une synthèse continue du brin précoce. 

 

 

 

 

 

Le brin complémentaire est synthétisé en sens opposé et est appelé le brin tardif et dans ce cas l'ADN polymérase effectue la synthèse en partant de la fourche.   Des petits fragments d'environ 135 nucléotides sont alors produits par cette polymérase.  Pour ce brin, le sens 5'--3' va en s'éloignant de la fourche de réplication et l'ADN polymérase doit attendre que la fourche de réplication expose d'avantage d'ADN avant de pouvoir synthétiser un autre court fragment d'ADN.  Ces fragments appelés fragments d'Okazaki sont ensuite reliés par une enzyme appelée l'ADN ligase et le nouveau brin formé est le brin retardé.

 

6. La Réaction de Polymérisation en Chaîne (Polymerase Chain Reaction (PCR))

Il y a quelques années , les chercheurs ont perfectionné la technologie d'utilisation des ADN polymérases afin de copier un brin d'ADN situé en dehors de la cellule. La technique est connue sous le nom de réaction de polymérisation en chaîne (PCR).   De petites quantités d'ADN retrouvées sur la scène d'un crime peuvent être copiée par l'ADN polymerase et ceci peut être effectué par un instrument qui automatise les changements de température rapide et précise qui sont nécessaires pour copier un brin d'ADN.  En l'espace de quelques heures, l'ADN peut être copié un million de fois.

La condition préalable à la réalisation de la PCR est la connaissance au moins partielle de la séquence de l'ADN.  Le mélange réactionnel d'une PCR contient l'ADN matriciel, l'ADN polymérase, les deux amorces et un mélange de dNTP.  C'est la polymérase Tag (bactérie Thermus aquaticus) résistant à 95°C qui est souvent utilisée.  Tenant compte de l'information partielle se rapportant à la séquence de l'ADN, deux oligonucléotides de 15 à 20 résidus sont synthétisés et s'hybrident chacun sur l'un des deux brins complémentaires et encadrent la région d'ADN à amplifier.  Le procédé expérimental se déroule comme suit:  Le mélange réactionnel est chauffé à 95°C conduisant à une dénaturation.  La température est alors abaissée à 55°C et les amorces s'associent aux deux brins complémentaires, c'est l'hybridation servant de point de départ à l'action de l'ADN polymérase.  C'est dans le sens 5'--3' que la synthèse est effectuée le long des simples brins matriciels, c'est la polymérisation.  La réaction engagée est interrompue par un chauffage court à 95°C si bien que les doubles brins nouvellement formés sont dénaturés.  La température est amors redescendue à  55°C et les amorces en large excès se réhybrident avec le brin parental et le brin fils.  Au cours de ce deuxième cycle

  l'ADN polymérase synthétise quatre brin fils.  Ce processus peut se répéter indéfiniment et après 20 à 30 cycles réactionnels le segment d'ADN se trouvant        entre les amorces a été amplifié de plusieurs millions de fois.  Il est possible d'amplifier une molécule d'ADN unique jusqu'à ce qu'elle devienne le produit majoritaire du mélange réactionnel et cet ADN majoritaire donne une bande intense après une électrophorèse sur gel.  La technique est très sensible aux traces d'ADN contaminant. 

La réaction de polymérisation en chaîne PCR est une méthode de choix dans le diagnostic viral , la recherche de défauts génétiques ainsi qu'en médecine légale de par l'utilisation des empreintes génétiques.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7.  Enzymes de restriction