Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR)

Dr. DIEDEN R.

 

Introduction à la RMN 2D

1. Rappel : L’expérience RMN 1D

Une particule nucléaire de spin I=1/2 placée dans un champ magnétique B0 peut, en raison de son moment magnétique m (=gI) , adopter deux orientations erlatives à ce champ: parrallèle (a) ou antiparallèle (b).  Ces deux états diffèrent en énergie, la différence en énergie entre les deux étant propotionelle au champ magnétique B­0 (Figure 1).

Figure 1 : Niveaux énergétiques d’un particule de spin I=1/2 en présence d’un champ magnétique B0

De même, un moment magnétique placé dans un champ magnétique subit une force F, qui engendre un mouvement de précession du moment magnétique m  autour de la direction du champ magnétique B0.  Pour tout un ensemble de spins, la loi de BOLTMANN prédit une population relative des deux états a et b qui est fonction de la différence d’énergie entre eux, entraînant une population de l’état a, Na, plus élevée que celle de l’état b, Nb.  La résultante M de tous les moments magnétiques individuels sera, dès lors, non nulle et parallèle au champ B0.  Les composantes de M dans le plan perpendiculaire au champ B0 seront, toutefois, nulles puisque les moments individuels ne précessent pas en-phase (Figure 2).

               Figure 2 : Mouvement d’un spin individuel et magnétisation macroscopique.

Cette magnétisation M étant extrêmement faible, il n’est pas possible de la mesurer quand elle est parallèle au champ très intense B0.  En la faisant basculer dans le plan perpendiculaire xy on pourra détecter la  tension électrique induite par M dans une bobine située dans le plan xy (Figure 3).

Figure 3 : La mesure du signal RMN.

Afin de pouvoir faire passer un moment magnétique individuel m de l’état a à l’état b on doit disposer d’un champ magnétique auxiliaire B­­1 perpendiculaire à B0.  Les moments magnétiques excités par ce champ précesseront alors en-phase, ce qui aura comme effet macroscopique une magnétisation non-nulle dans le plan xy (Figure 4).

Figure 4 : Passage de l’état fondamental a à l'état excité b et création d’une magnétisation transversale non-nulle.

Cette magnétisation transversale qui précessera autour de l’axe z induira un signal cosinusoïdal, dont la fréque ce correspondra à la fréquence de Larmor w des spins.  La relaxation des spins, c.à.d. le repassage des spins individuels de l’état excité vers l’état fondamental (relaxation longitudinale liée au temps T1) et leur déphasage (relaxation transvesale liée au temps T2) amènera l’intesité de cette cosinusoïdale àdécroître exponentiellement, ce qui donnera sa forme caractéristique à l’interférogramme, alias FID (Free Induction Decay).  Plus la relaxation est rapide, plus le FID décroîtra rapidement et le pic observé après transformée de Fourier, sera large (Figure 5).

Figure 5 : Magnétisation transversale, FID et relaxation.

2. L’échantillonnage du FID : Théorème de Nyquist.

Avant de pouvoir subir la transformée de Fourier, le FID doit être transformé en forme digitale.  Cette opération est effectuée par le convertisseur analogique-digital (A/D-converter).[1]  Cet appareil convertit le voltage induit par la magnétisation dans la bobine de réception (Figure 5) en un nombre digital, et ce à des intervalles de temps régulièrement espacés (dwell-time).  La vitesse d’acquisition (=1/(acquisition Time) = 1/(dwell-time * nombre de points) ) est imposée par le théorème de l’échantillonnage.

Figure 6 : Le signal RMN

La fréquence qui est échantillonnée exactement deux fois par période est appelée la fréquence de NYQUIST.  C’est la fréquence la plus élevée qui pourra être représentée correctement.  En effet, une sinusoïde de fréquence F doit être représentée par (au moins) deux points par période (Figure 6&).  Sinon, on peut trouver deux sinusoïdes, de fréquences F + f et F-f, qui passent par les mêmes points, créant ainsi une ambiguïté (Figure 6b).

Figure 7 : Echantillonage du FID et théorème de NYQUIST

Ce théorème montre outre la nécessité de filtres pour éliminer les fréquences plus élevées, que l’acquisition d’un spectre d’une largeur de Dw0 Hz, nécessite un échantillonnage à une vitesse e (au moins) 2 Dw0 points par secondes.

La deuxième dimension : la RMN 2D.

La RMN à deux dimensions a été proposée par J. JEENER de l’ULB en 1971.[2]  Depuis, la technique a connue un essor formidable comme en témoignent les nombreuses applications à l’élucidation de la structure de composés organiques[3],[4] et inorganiques, autant en solution qu’à l’état solide. [5]  Bien qu’il existe une foule d’expériences différentes (cfr. Annexes 1 et 2), utilisant différentes séquences d’impulsions de plus en plus compliquées, le principe de base est toujours le même.

La nature de la deuxième dimension : marquage des fréquences

Classiquement, on décrit une expérience RMN 1D comme étant compose de deux périodes : la préparation (D1) et la détection (t2) (Figure 8a).  La RMN 2D ajoute la période d’évolution (t1) (Figure 8b).

Dans le cas le plus simple la préparation consiste simplement en le délai de relaxation, c.à.d. le temps entre deux cycles d’impulsions.

Comme le nom l’indique, pendant le délai d’évolution (t1) on laisse évoluer les spins.  C’est l’incrémentation de t1 lors de chaque cycle qui constitue le marquage de fréquences.  La transformée de Fourier par rapport à ce paramètre permettra l’obtention d’un spectre à deux dimensions.

Figure 8 : Quelques exemples de séquences d’impulsions simples : a) séquence 1D, b) la séquence 2D la plus simple possible, c) séquence COSY, d) séquence NOESY

 

 

 

 

 

Dans le cas le plus simple, la préparation consiste simplement en le délai de relaxation, c.à.d. le temps entre deux cycles d’impulsions.

Comme le nom l’indique, pendant le délai d‘évolution (t1) on laisse évoluer les spins.  C’est l’incrémentation de t1 lors de chaque cycle qui constitue le marquage de fréquences.  Ma transformée de Fourier par rapport à ce paramètre permettra l’obtention d’un spectre à deux dimensions.

La détection est la période pendant laquelle les points constituant le FID sont acquis (t2), comme en RMN 1D.

 

Un premier exemple : Correlation Spectroscopy

Bien que la séquence d’impulsion de base de l’expérience COSY soit très simple (il n’y a que deux impulsions (Figure 8c), cette technique constitue, toujours, le cheval de bataille des spectroscopistes.

Un spectre COSY se présente de la façon suivante (Figure 9).

L’axe horizontal (F2, provenant de t2) et l’axe verticale (F1, provenant de t1) donnent toutes les deux le déplacement chimique (du 1H, en général pour un COSY).  La projection du spectre sur ces axes donnera une représentation du spectre 1D.  On distingue deux sortes de signaux : les signaux diagonaux (diagonal peaks ou autocorrelation-peaks) et les signaux hors diagonale (cross-peaks).  C’est ces derniers qui nous intéressent : ils indiquent la présence d’un couplage entre les deux noyaux dont les signaux possèdent les déplacements chimiques indiqués par les coordonnées du cross-peak.

Figure 9 : Spectre COSY de l’acide b-acrylique.  a) stacked plot, b) contour plot.

 

Imaginons maintenant ce qui se passera au niveau nucléaire si l’on applique la séquence d’impulsion COSY :

  1. Au départ la magnétisation se trouve alignée le long de l’axe z (Figure 10).  L’impulsion de 90° appliquée le long de l’axe x (p/2)x la fera basculer le long de l’axe y.

Figure 10 : Représentation de la séquence COSY.

  1. Pendant l’intervalle t2, la magnétisation précessionnera autour de l’axe z avec une vitesse angulaire w0 = gB0.  L’angle parcouru après un temps t1 sera donc de w0t1 et l’amplitude de la projection sur l’axe y de la magnétisation My variera de manière sinusoïdale.  L’acquisition du signal RMN donnera un FID composé de N2 points espacés (dans le temps) de (1/2 SW2)s, SW2 (sweep width) étant la largeur du spectre (en Hertz) dans la dimension F2.
  2. Après la relaxation, on recommence au point (1).  L’intervalle t1 est incrémentée de 1/(2 SW1), la largeur du spectre (en Hertz) dans la dimension F1.  On obtiendra après acquisition le même FID qu’en (2) mais décalé en phase de w0t1=gB0t1 radians, c.à.d. l’arc de cercle que la magnétisation aura migrée pendant ce temps.  La répétition de ce cycle N1 fois donnera une série de N1 FID’s espacés dans le temps de 1/(2 SW1) s (Figure 11a) et composés chacun de N2 points espacés dans le temps de 1/(2 SW2)s.  Il s’git donc d’une matrice de N1*N2 points dont les rangées diffèrent en t2 et dont les colonnes diffèrent en t1.

Figure 11 : La première et la deuxième transformée de Fourier.

  1. La transformée de Fourier par rapport à t2 nous fournira une série de N1 spectres d’une largeur de SW2 Hz séparés de 1/(2 SW1) s (Figure 11b).  On a maintenant une matrice dont les colonnes diffèrent en fréquence (v2) et dont les rangées diffèrent en t1.  Alors que chaque rangée représente une spectre 1F acquis avec une valeur de t1 différente, chaque colonne est donc composée de N1 points séparés de 1/(2 SW1) s et constitue un pseudo-FID (Figure 11b, Figure 12) qui, de nouveau pourra subit une transformée de Fourier.

Figure 12 : Une colonne de la matrice du COSY après la première transformée de Fourier.

  1. Après cette seconde transformée de Fourier par rapport à t1 de chaque colonne, on obtient un spectre de SW2 * SW1 Hz (Figure 11c)

 

La Figure 11 montre comment on obtient un signal diagonal.  Malheureusement, il est  beaucoup plus difficile de représenter par un simple modèle vectoriel l’obtention des cross-peaks.  Il faut alors recourir à des modèles mathématiques comme le modèle des matrices de densité de spin ou, plus simple, le modèle des opérateurs de spin.  Ces deux modèles parviennent, au prix d’un appareil mathématique un peu lourd, à expliquer tous les phénomènes de transfert de cohérence.

Application : Les plus importants types de spectres RMN 2D.

Dans les paragraphes suivants ne sont présentés que les séquences les plus communes.  Une liste[6] comparative des différentes techniques (nom, applications, avantages/désavantages) plus complète mais pas exhaustive peut être trouvée dans les Annexes 1 et 2.

Simplification de spectres 1D : les spectres J-résolus

Les spectres J-résolus présentent en une dimension les déplacements chimiques et dans l’autre dimension les couplages.  Il existe des variantes homo-nucléaires (ex. : résolution des couplages 1H-1H, Figure 13) et des variantes hétéro-nucléaires (ex. : résolution des couplages 13C-1H).  L’intérêt de ce type de spectres se limite à la  simplification de spectres encombrés, la détermination aisée des multiplicités et la détermination des constantes de couplage.

Figure 13 : Spectre homo J-résolu de l’acide acrylique

 

Détection des liaisons chimiques : couplage scalaire

Une autre famille de techniques permet de mettre en évidence l’existence de couplages scalires (ou couplage J) entre deux types de noyaux.  Il existe de nouveau des variantes homo-nucléaires et des variantes hétéro-nucléaires.

L’expérience de corrélation par couplage J entre noyaux dumême type s’appelle COSY (COrrelation SpectoscoY) s’il s’agit de noyaux abondants (1H, 31P, …).  Un cross-peak indique l’existence d’un couplave scalaire entre les noyaux correspondants (Figure 14).

Figure 14 : Spectre COSY du bis(heptadiényl) Osmium

 

Outre un grand nombre de variantes de cette expérience (suppression de solvant, de singulets, optimisation pour couplages à longue-distance, etc…) il existe la famille des techinques TOCSY (TOotal Correlation SpectroscopY, ou HOHAHA (HOmonuclear Hartmann-Hahn spectroscopy) ou encore MLEV (d’après Malcolm LEVitt)).  Ici, le spectre montre un ross-peak entre un noyau et tous les noyeaux couplés diectement ou indirectement.  Ceci est très intéressant dans le cas des peptides ou protéines, où tous les signaux correspondant à un acide aminé particulier sont immédiatement attribués ().

Figure 15 : Spectre TOCSY et structure du peptide didemnin-B

 

Une version spéciale très puissante constitue l’arme ultime du spectroscpiste RMN pour la détermination de la structure de composés organiques, puique elle indique la présence ou non d’une liaison chimique entre deux moyaux de carbone.  Elle n’est toutefois que très rarement utilisée et ce parce que son nom est, malheureusement, très bien choisi : 2D- INADEQUATE (INcredible Natural Abundance DoublE Quantum Transfer Experiment).  Cette technique utilise les couplages entre les noyaux de 13C cet comme ceux-ci sont très rares (1.1 %), les noyaux de 13C ayant un noyau ce 13C comme coisi les sont d’autant plus (1.1%*1.1%=0.01%) ce qui explique la sensibilité très faible de cette technique.  Le spectre (Figure 16) montre dans une dimension les déplacements chimique 13C et dans l’autre la fréquence de double quantum (c.à.d. la somme des déplacements chimiques exprimés en Hz).

Figure 16 : Spectre 2D-INADEQUATE

Corrélations hétéronucléaires

La version hétéronucléaire de COSY s’appelle soit HETero CORellation spectroscopy (HETCOR) ou simplement X,H Correlation Spectroscopy (ex : 13C-1H Correlation).  Un cross-peak dans un tel spectre indique, p.ex. que les hydrogènes dont le signal possède un déplacement chimique correspondant à l’ordonnée, sont attachés aux atomes de carbone possédant le déplacement chimique indiqué par l’abscisse (Figure 17).

Figure 17 : Spectre de corrélation 13C-1H du bis(heptadiényl) Osmium

Encore une fois, il existe toute une panoplie de variantes, comme par exemple les expérience optimisés pour les couplages à longues distance (COLOC) et, très important, les techniques à détection inverse (on détecte le 1H et pas le 13C, ce qui rend la technique (beaucoup) plus sensible.

L’information spatiale et l’échange chimique

La version à deux dimensions de la mesure de l’effet Overhauser nucléaire[7] (n.O.e.) s’appelle Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY (NOESY).  D’une manière simplifiée, le principe repose sur le couplage dipolaire ou plus précisément la relaxation croisée.  En présence de couplage dipolaire, la relaxation de l’un des partenaires de couplage peut entraîner l’excitation de l’autre.  La magnétisation se retrouve donc sur un autre noyau que celui de départ (la polarisation des spins aura été transférée d’un noyau sur un autre possédant un déplacement chimique différent).  Le spectre NOESY (Figure 18 : Spectres COSY et NOESY de l’acide pamoïque.) nous montre un cross-peak s’il y a eu transfert de magnétisation entre les deux noyaux.  Vu le mode de fonctionnement de cette expérience il faut toutefois être conscient qu’un autre phénomène peut entraîner un changement de déplacement chimique de la polarisation.  En effet, il se peut que ce ne soit pas uniquement la polarisation des spins qui change de place, mais tout l’atome.  On est alors en présence d’échange chimique.

Figure 18 : Spectres COSY et NOESY de l’acide pamoïque.

Comme pour le COSY, le NOESY possède également sa variante dans le référentiel tournant : la Rotating frame nuclear Overhauser Effect SpectroscopY (ROESY, ou CAMELSPIN (Crossrelaxation Appropriate for Mini-molecules EmuLated by SPINlocking), Figure 18 ).  Cette expérience, bien qu’un peu plus compliquée à mettre en œuvre que le NOESY, présente une série d’avantages qui lui ont valu être actuellement la méthode de choix et ce surtout pour l’étude des protéines :

-         au contraire du n.O.e., le r.O.e. est toujours positive

-         les signaux dus à l’échange chimique et au couplage dipolaire peuvent être distingués : les premiers ont la même phase que les signaux diagonaux, alors que les seconds possèdent la phase inverse, respectivement.

-         Les spectres NOESY et ROESY sont spécialement intéressantes pour la détermination de distances interatomiques.

 


 

[1] Martin, M.L.; Delpuech, J-J.; Martin G.J. Practical NMR Spectroscopy, Heyden & Son LTd.: London, 1980, pp.28.

[2] Jeener, J.  Ampere International Summer School, Basko Polje, Yugoslavia, 1971.

[3] Martin, G.E. ;Zektzer, A.S. Two-Dimensional NMR Methods for Establishing Molecular Connectivity : A Chemist’s Guide to Experimental Selection, Performance and Interpretation, VCH Publ., Inc. : New York, 1988.

[4] Croasmun, W.R. ; Carlson, R.M.K. Two-NMR Spectroscopy.  Applications for Chemists and Biochemists, VCH Publ., Inc. : New York, 1987.

[5] NMR Techniques in Catalysisn Bell, T.; Pines, A., Ed.; Marcel Dekker, Inc. : New York, 1994.

[6] Evans, S.R.; Hayman, A.R.; Fellows, L.E.; Shing, T.K.M.; Derome, A.E.; Fleet, G.W.J.  Tet. Lett. 1985, 76, 1465.

[7] Neuhaus, D.; Williamson, M. The Nuclear Overhauser Effect in Structural and Conformational Analysis, VCH Publ., Inc. : New York, 1989.