Drugs of Abuse

     Dr. Lhoëst G.J.J.                                                                                 

Plan

1. Introduction    

  2 . Drogues sujettes à abus   

      Les narcotiques    

       Les Hallucinogènes      

      Dépresseurs du SNC   

   Les Stimulants  

 3. Méthodes d'extraction des drogues       

Types d'Echantillons           Microextraction en phase solide (SPME)        Isolement Albutérol Plasma  

Traitement préliminaire                  Instrumentation SPE                                            Chromatographie colonne 

Extraction liquide-liquide              Développement méthode SPE                           Séparation par membranes   

Extraction SPE                                 Les Phases SPE                                                     Changement de colonne  

Utilisation SPE                            Guide d'application SPE                                     Principe d'opération 

Dispositif SPE                                  Les lignes de conduite                                      Chromatographie multidimensions 

Dérivatisation                                  Colonnes             Les phases stationnaires        Spécifications colonnes   

 

4.  Identification des drogues                DART 

 

1. INTRODUCTION

   L' abus des drogues et d'autres xénobiotiques n'est en aucune façon un phénomène nouveau  puisque des documents et évidences existent prouvant cet état de fait sous diverses formes et depuis des milliers d' années . C' est néanmoins un problème majeur dans la plupart des contrées du monde et le phénomène paraît être en progression . La plupart des pays ont des lois qui essaient avec des degrés variés de succès de modifier , d'interdire la consommation de certaines drogues et l'application de ces lois nécessite une quantité considérable de travail analytique afin de prouver l'évidence de la violation de la loi .   Le problème n'est cependant pas simplement un problème légal . Dans de nombreux cas , les drogues cliniques sont consommées en des quantités excessives par accident et la connaissance de la nature du produit ingéré est souvent essentielle pour un traitement efficace particulièrement si des dommages cellulaires induits métaboliquement peuvent survenir .

  La définition de ce qui constitue un abus n'est pas aisée . Kneuknelian a proposé de définir l'usage abusif  des drogues comme " un usage non défini de toute substance clinique ( excepté la nourriture ) ajoutée à l'organisme pour modifier son fonctionnement normal " . Il y a eu des centaines d'études visant à définir l' étendue du problème de l'abus des drogues dans diverses parties du monde . Une étude réalisée en 1974 estimait qu'aux Etats - Unis , 15 à 20 millions d'échantillons d'urine sont analysés annuellement pour des drogues sujets à l'abus . En 1969 , on a estimé à plus de 400000 les personnes intoxiquées aux Etats - Unis avec 100.000 dans l' Etat de New York . Une étude rapportant l'usage d'opiacés parmi les jeunes gens en Italie , a conclu qu'il y avait 68000 jeunes qui s' adonnaient à des drogues du type opiacés en 1980 et qu'ils étaient 92000 en 1982 .Une autre étude réalisée en Angleterre indiquait que dans certaines régions 15 à 18 % de tous les cas admis dans les hôpitaux l'étaient pour des problèmes de drogues.  

  Une estimation de ce qui constitue les drogues les plus largement utilisées dépend évidemment des critères utilisés pour classer ces composés . Cependant dans presque tous les systèmes de classification , l'alcool et le tabac apparaissent au sommet suivis par ordre de dommage décroissant par les amphétamines , les solvants , les barbituriques,l'héroine, la cocaine , les hallucinogènes , les préparations de canabis et la cafféine . Quant aux drogues le plus souvent responsable de mort,de nouveau l'alcool apparaît en premier lieu.

Dans le comté de Los Angeles pour la période de 1974 - 1981 , les causes de mort dues à l'alcool étaient bien plus élevées que pour 34 autres drogues et se chiffraient pour cette période de 1206 à 2295 , le dernier chiffre étant environ 20 fois supérieur aux morts à imputer à la phencyclidine ( 122 cas) et représentant la drogue qui après l'alcool conduit à la plus grande fréquence de mortalité . Sur la même période , les morts dues aux barbituriques tombaient de 340 à 83 tandis que celles dues à la morphine restaient relativement constante de 40 à 56 .

Dans une autre étude se rapportant aux accidents dus à la circulation , Cinbura utilisa la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GCMS) , pour confirmer les résultats obtenus par d'autres méthodes d'identification afin d'analyser les types de drogues trouvées pour 484 cas mortels répertoriés dans une population de chauffeurs et de piétons en Ontario . L'éthanol fut trouvé dans 57 % des cas et d'autres drogues dans 26 % des échantillons . Cependant seulement 9.5 % des échantillons étaient des drogues psychoactives autres que l'éthanol détectées à des concentrations qui peuvent affecter la conduite . Celles qui étaient rencontrées le plus fréquemment étaient le Cannabis et le Diazépam .

    En ce qui concerne l'identification des drogues , la spectrométrie de masse est une discipline généralement considérée par les experts scientifiques  comme une méthode non primaire d'identification lorsque des quantités relativement importantes d'échantillons sont disponibles . Cependant , sa sensibilité peut être utilisée avantageusement lorsque de petites quantités de substances sont disponibles et est une discipline d'une valeur inestimable pour confirmer l'exactitude des résultats obtenus par des méthodes moins spécifiques qui sont en général les méthodes d'identification primaires .

 Le scientifique engagé dans le dépistage des drogues est susceptible de rencontrer un très grand nombre de composés et leurs métabolites possibles . Un analyste expérimenté lorsque confronté avec un échantillon de drogue illicite , dans la plupart des cas doit procéder à des méthodes de dépistage simple pour pouvoir fournir l'information . Comme un grand nombre d'échantillons doivent souvent être examinés , des méthodes d'identification structurelle comme la spectrométrie de masse sont rarement utilisées dans un premier temps et des techniques de TLC sont utilisées . Cependant des méthodes rapides peuvent être soumise à erreur et la spectrométrie de masse est souvent utilisée pour confirmer les résultats lorsque les quantités de métabolites actifs dans les fluides biologiques deviennent trop faibles . La versatilité de la méthode est extrêmement utile pour dépister des cas où plus d'une drogue et métabolites sont présents dans les fluides biologiques .

    Une publication allemande a mis en valeur les mérites de l'ionisation par impact électronique ( EI) et à la fois de l'ionisation chimique positive et négative (CI) en spectrométrie de masse pour le dépistage toxicologique de 2000 intoxications et ceci pour les drogues les plus fréquemment rencontrées .

         Drogues            Nombre de cas                  Pourcentage
Benzodiazépines                             455                     36,6
Barbituriques                             324                     26,0
Pyrazolones                             170                     13,6
Diphenhydramine                             117                       9,4
Antidépresseurs tricycliques                               97                       7,8
Phénothiazines                               82                       6,6

Les benzodiazépines avec 455 cas forment la tête de liste suivis par les barbituriques (324 cas) , par les pyralones (170 cas) , la diphenhydramine (117 cas) , les antidépresseuurs tricycliques (97 cas) et les phénothiazines ( 82 cas ) étant rencontrés moins fréquemment .Il faut insister sur le fait que la méthode la plus appropriée en spectrométrie de masse varie avec la drogue . Des réactions de dérivatisation sont réalisées si la chromatographie en couche mince révèle la présence d'une drogue qui n'est pas révélée par la chromatographie en phase gazeuse .

 Une autre méthode récemment publiée qui écarte souvent le dépistage préliminaire par TLC et la nécessité d'utiliser la GCMS est basée sur l'utilisation d'un spectromètre de masse à triple analyseurs qui a notamment été utilisé pour l'analyse de 50 drogues dans le serum. Dans ce cas le dépistage initial a été réalisé en utilisant un ion parent choisi et en examinant le spectre des ions filles obtenus . Ces spectres d'ions filles peuvent être comparés à des spectres de librairie obtenus sur des produits purs .

Une autre manière d'éliminer la nécessité de réactions de dérivatisation pour des drogues polaires est de faire usage, dans le cadre de l'identification, de la LCMS ou de la LCMSMS en utilisant des modes d'ionisation du type thermospray ou actuellement electrospray donnant accès à des informations structurelles combinées .  

 

2. Drogues sujettes à abus 

Une drogue peut être définie comme une substance naturelle ou synthétique qui est utilisée pour produire des effets physiologiques ou psychologiques chez l'homme ou chez les animaux supérieurs.  Le terme drogue peut avoir une signification variée dépendant des personnes auxquelles on s'adresse.  Pour certains, une drogue est un moyen pour supporter et prolonger la vie, pour d'autres une drogue est un moyen pour se dégager des pressions de la vie, pour d'autres encore un moyen pour en finir avec la vie.  Etant donné le large éventail de conceptions qu'une drogue peut avoir aux yeux des citoyens de diverses conditions sociales, il n'est pas étonnant que des segments de la population puissent en abuser dans notre société.  Ce furent d'abord des hallucinogènes, des amphétamines et des barbituriques qui en provenance de laboratoires et de pharmacie inondèrent la rue dans les années 1960.  A partir de 1980 , la marijuana devint la drogue illicite la plus utilisée aux Etats Unis et la consommation d'alcool continua de s'élever .  Il y a environ 90 millions d'Américains qui en boivent régulièrement et 10 millions qui peuvent être considérés s'adonner à cette boisson avec existence  de problèmes sérieux.  Dans les années 1970, ce fut la consommation d'héroïne qui posa un problème national suivi par un usage abusif de cocaïne.  Actuellement, on peut considérer qu'il y a aux Etats-Unis 23 millions de personne faisant usage de drogues illicites, qu'il y en a 500.000 qui sont des héroïnomanes et six millions s'adonnant à l'abus de cocaïne.  Cette situation a eu pour conséquence que 75 % des évidences qui sont recherchées dans les laboratoires d'investigations criminelles ont un rapport avec la drogue.et a également eu pour effet que des mesures ont été prises afin d'augmenter les capacités analytiques des laboratoires d'investigations criminelles parfois au détriment des homicides ou d'autres types de crimes sérieux.

2.1 La dépendance à la drogue

La dépendance à la drogue peut revêtir des aspects variés et présenter tous les degrés d'intensité dépendant de la nature de la drogue, de la voie d'administration, de la dose, de la fréquence d'administration et des vitesses de métabolisation individuelle. La question de savoir comment définir et mesurer l'influence de la drogue chez un individu et de se rendre compte de danger que cela peut poser pour la société est difficile à évaluer.  Dans ce contexte, la nature et la signification de la dépendance à la drogue doivent pouvoir être jugées en tenant compte d'une part de l'intéraction de la drogue avec l'individu et d'autre part de l'impact de cette drogue sur la société.   Le problème peut être approché à partir de deux aspects différents du comportement humain : la dépendance psychologique et la dépendance physique.  L'intensité de la dépendance psychologique résultant de la consommation d'une drogue est difficile à définir et dépend de la nature de la drogue utilisée.  Pour des drogues comme l'alcool, l'héroïne, les amphétamines, les barbituriques et la cocaïne, il y a une forte probabilité qu'un usage continu va provoquer un état de dépendance.  D'autres substances comme la marijuana et la codéine présenterait une potentialité moindre pour le développement de dépendances psychologiques sans toutefois vouloir dire qu'un faible potentiel de dépendance psychologique doit être considéré comme sans danger.  Dans le cas de l'alcool par exemple nous savons qu'il ne faut pas généraliser le danger de l'abus de cette drogue.  Tous les consommateurs ne sont pas psychologiquement dépendant mais sont des consommateurs qui peuvent être classés dans la catégorie des "buveurs sociaux" consommant des quantités raisonnables et de façon irrégulière.  Il y a des groupes d'individu qui ont dépasser ce stade et pour qui le degré de dépendance psychologique doit être faite sur une base individuelle.  Les mêmes remarques peuvent être faites pour les consommateurs de marijuana en se rendant compte que les consommateurs de fortes doses de marijuana s'expose au danger de développer un haut degré de dépendance psychologique.  Lorqu'un bien être émotionnel est le motif primaire conduisant à la consommation répétée et intensive de drogues, il est alors possible que certaines drogues, lorsque consommée à dose et à une fréquence suffisante , puissent être capable de produire des modifications physiologiques qui encouragent leur consommation en continu. Lorque la personne s'adonnant à cette drogue s'en abstient, des troubles physiques sévères peuvent apparître.  C'est le désir d'éviter ce syndrome d'abstinence qui finalement provoque la dépendance physique.  Ainsi pour les consommateurs habitué à recevoir de fortes doses d'héroïne; la pensée de devoir subir les conséquences d'une abstinence comme le vomissement, des crampes d'estomac, des convulsions, des insomnies, de la douleur et des hallucinations sont souvent des raisons suffisantes pour poursuivre la consommation de la drogue.  Par contre, des drogues comme la marijuana, le LSD et la cocaïne créent de fortes anxiétés lorsque leur usage répété est interrompu.mais il n'y a pas d' évidences médicales qui puissent attribuer ces inconforts à des réactions physiologiques accompagnant l'abstinence.  Par contre la consommation d'alcool, d'héroïne et de barbituriques peut résulter dans le développement de dépendance physique.   Ce phénomène de dépendance physique se développe seulement lorsque l'interval entre les doses est suffisamment court si bien que les effets ne sont jamais complètement supprimés.  L'interval entre deux injections d'héroïne n'excède probablement pas  six à huit heures chez les groupes d'individu qui en abusent.  Après ce temps des symptomes d'abstinence commencent à se développer.  De façon similaire, le risque de dépendance à l'alcool devient plus grand lorsqu'une consommation appréciable est continue pendant la journée .

La table ci-dessous référencie les drogues dont on abuse le plus communément et résume les tendances à produire des dépendances psychologiques et d'induire des dépendances physiques lorsque l'usage est répété.

            Drogues    Dépendance psychologique        Dépendance physique
Narcotiques    
Morphine Elevée Oui
Héroïne Elevée Oui
Methadone Elevée Oui
Codéine Faible Oui
Dépresseurs    
Barbituriques (à courte durée d'action Elevée Oui
Barbituriques (à longue durée d'action) Faible Oui
Alcool Elevée Oui
Methaqualone (Quaalude) Elevée Oui
Meprobamate (Miltown, Equanil) Modérée Oui
Diazepam (Valium) benzodiazépines Modérée Oui
Chlordiazaepoxide (Librium) Modérée Oui
Stimulants    
Amphetamines Elevée  
Cocaïne Elevée Non
Caféine Faible Non
Nicotine Elevée Oui
Hallucinogènes    
Marijuana Faible Non
LSD Faible Non
Phencyclidine (PCP) Elevée Non

 

2.1.1 Les Narcotiques     

Le terme narcotique est dérivé du mot grec narkotikos qui implique un état de léthargie ou de paresse.  Les pharmacologues classifient les drogues narcotiques comme des substances qui soulagent la peine et produisent le sommeil.  Les narcotiques sont des analgésiques qui exercent leur action dépressive sur le système nerveux central.  L'usage régulier de drogues narcotiques va invariablement produire un état de dépendance physique avec toutes ses conséquences .  La source de la plupart des narcotiques analgésiques est l'opium , un jus gluant ecsudant d'une incision faite dans la cosse non mûre de papaver somniferium, une olante poussant majoritairement en Asie.  L'opium est brûnatre de couleur et présente une teneur en morphine entre 4 et 21 %.  La morphine est rapidement extraite de l'opium mais le dérivé acétylé que les adeptes à ce genre de drogues préfèrent utilisés et qui est l'héroïne.  Cette dernière est synthétisée par réaction avec l'anhydride acétique. (voir figure).   

La haute solubilité de l'héroïne dans l'eau fait que son usage en injection intraveineuse dans la rue est assez simple.  C'est par cette voie que les effets sont presque instantanés.  La préparation de la drogue pour l'injection se fait généralement en la dissolvant dans une petite quantité d'eau contenue dans une cuillère et en chauffant éventuellement cette dernière avec une bougie afin d'accélérer la solubilisation. L'eau de solubilisation peut contenir éventuellement un peu d'acide ascorbique ou citrique.  La solution est alors aspirée dans une seringue et l'injection est alors faite.  Outre le fait d'être un analgésique puissant , l'héroïne produit un effet de somnolence et une sensation profonde de bien être qui perdure pendant trois à quatre heures.  Pendant de nombreuses années (1960-1975), le contenu d'un sac d'héroïne avait une teneur de 15 à 20 % d'héroïne.  Par après sa concentration à été réduite (2 à 5 %).  Le consommateur se préoccupe rarement du contenu des autre 95 %.  Traditionnellement, la quinine a été le diluent le plus commun de l'héroïne.  D'autres diluants de l'héroïne communément utilisés sont l'amidon, le lactose, la procaïne ( Novocaïne) , le mannitol .  Afin d'obtenir certains effets supplémentaires la drogue des produits peuvent y être ajoutés comme la caffeine, le paraacetamol, la codeine , le diazepam et le mélange d'héroïne et de cocaïne est connu sous le nom de "speedball".  Il est à signaler que l'héroïne peut également être obtenue sous une forme très pure et peut alors être fumée, une pratique qui alors remplace l'injection.  D'une manière générale l'ignorance de la oureté et de la teneur en héroïne dans les paquets dilués conduit à des surdosages qui sont souvent fataux.

La codéine est également présente dans l'opium mais elle est préparée habituellement synthétiquement à partir de la morphine. La codéine est communément employée comme antitoussif dans des sirops contre la toux.  La codéine ayant une activité six fois moindre que la morphine, elle est rarement utilisée dans la rue par les consommateurs de drogues.  Il faut cependant signaler que la codéine peut parfois être prise dans des cas extrême à des concentrations dix fois supérieures  à une dose journalière d'environ 500 mg. afin d'obtenir des effets plus ou moins similaires à l'héroïne parfois pour pallier à un manque d'approvisionnement.  La dihydrocodéine (DHC) est comparable à la codéine mais cette dernière est plus prisée par les consommateurs de drogues et dans ce cas les doses journalières entre 300 et 500 mg ont été augmentées jusqu'à 5000 mg en y ajoutant de l'alcool ou d'autres substances comme l'héroïne, des benzodiazépines et la cocaïne.  L'utilisation de la dihydrocodéine seule est rare.

 

 Il y a un certain nombre de drogues appartenant au groupe des narcotiques qui ne sont pas dérivés de l'opium ou de la morphine mais qui présentent les mêmes effets physiologiques que les narcotiques dérivés de l'opium.  On leur donne le nom d'opiacés.  La méthadone est le plus connu des opiacés synthétiques  L'administration orale de methadone semble éliminer le désir des héroïnomanes à reprendre de l'héroïne et de plus elle produit des effets secondaires minimaux.  L'effet euphorique produit par l'héroïne peut être induit pour la méthadone par injection intraveineuse en combinaison avec de l'alcool, benzodiazépines etc.... Un autre narcotique synthétique est le propoxyphene commercialisé en 1957 sous le nom de Darvon.  Prescrite pour soulager des douleurs modérées , un usage abusif en a été fait et des incidents croissants résultant overdoses du produit ont pu être répertoriés si bien qu'elle a été de moins en moins prescrite comme médicament.

 

2.1.2  Les Hallucinogènes   

Les hallucinogènes sont des drogues qui peuvent provoquer des altérations marquées dans la façon dont les processus normaux de la pensée opère, dans les perceptions et les humeurs.  Un des réprésentants les plus populaires et aussi les plus contreversés de cette classe de drogues est la marijuana.

2.1.2.1  La marijuana

La marijuana est sans conteste la drogue illicite la plus utilisée aux Etats Unis puisque plus de 43 millions d'Américains l'ont essayé et que environ 22 millions d'Américains sont des utilisateurs réguliers.  La marijuana est une préparation dérivée de la plante Cannabis Sativa L.   La préparation consiste en les feuilles broyées mélangées en diverses proportions avec les fleurs, la tige et graines de la plante.  La plante secrète une résine gluante qui est connue sous le nom de hashish.  Ce matériel résineux  peut également être extrait en faisant tremper la plante dans un solvant alcoolique.  Le hashish est vendu sur le marché illicite sous la forme d'une végétation comprimée contenant un haut pourcentage de résine.  Une forme active de la marijuana est connue sous le nom sinsemilla. qui est constitué par la sommité fleurie non fertilisée des plantes femelles de Cannabis.  Ceci est réalisé par enlèvement de toutes les plantes mâles du lieu de culture au premier signe de leur apparition.  Il s'ensuit que la production de sinsemilla demande une grande attention et ceci ne se fait que sur de petites parcelles de terrain.  La marijuana et ses produits apparentés ont été utilisés légalement et illégalement depuis environ trois mille ans.  La première référence de l'usage médical de la marijuana peut se trouver dans un livre de pharmacie écrit en 2737 A.C. par l'Empereur Chinois Shen Nung qui recommendait son usage contre le rhumatisme, la malaria, le beriberi, la constipation.  Dans les années 500 de notre ére, on fit état de l'utilisation de marijuana dans la littératuire Persane et Arabe.  La plante qui pousse sous divers climats fut probablement apportée en Europe par les armées de Napoléon revenant d'Egypte au début du 19ème siècle et elle fut introduite aux Etats Unis vers 1920. 

Ce n'est qu'en 1964 que des scientifiques isolèrent une substance chimique largement responsable des propriétés hallucinogènes de la marijuana et qui porte le nom de tetrahydrocannabinol ou THC

Cette découverte a permi aux chercheurs de mesurer les potentialités des préparation de Cannabis chez l'homme.  Il a été trouvé également que la teneur en THC du Cannabis varie dans différentes parties de la plante et de façon décroissante de la résine, aux fleurs et puis aux feuilles.  Peu de THC est trouvé dans la tige, les racines et les graines.  La potentialité et l'effet résultant de la drogue varie avec la proportion relative des parties de la plante dans le mélange marijuana et donc de son conditionnement.  La marijuana sous sa forme végétale présente une teneur moyenne en THC de 1,5 %.  Une forme plus active le sensimilla présente une teneur moyenne de 3,5 à 4 % en THC et les préparations de hashish environ 3,5 % en THC.  Une autre forme de hashish est connue sous le nom de "hashish liquide" ou "huile de hashish" .   Sous cette forme le hashish est une substance visqueuse de couleur vert foncé et présentant une consistance goudronneuse.  Le hashish liquide est produit par extraction avec un solvant approprié de la résine riche en THC de la plante marijuana.  Ce hashish liquide a une teneur en THC entre 20 et 65 %.  Une goutte de ce matériel peut donner des sensations et normalement une goutte est placée sur une cigarette ordinaire ou sur une cigarette marijuana avant de la fumer.  

Il y a d'autres substances variant largement dans leur composition chimique et qui présentent des propriétés hallucinogènes et dont certaines sont répertoriées ci-dessous

2.1.2.2  L'acide lysergique diethylamide (LSD)

Le LSD est synthétisé à partir de l'acide lysergique et peut être obtenu à partir d'un champignon parasite de l'ergot de seigle.

Les effets hallucinogènes furent d'abord décrit par le chimiste Suisse Albert Hofman après avoir ingéré accidentellement le produit dans son laboratoire en 1943.  Una quantité de 25 µg est suffisante pour avoir des hallucinations visuelles et l'effet peut perdurer pendant 12 heures.  Cette drogue peut produire des changements marqués de l'humeur en passant du rire au cri à la moindre provocation.  Le sentiment d'anxiété et de tension accompagne également la consommation de LSD.  La dépendance physique ne se développe pas par l'utilisation continue de la drogue mais des réactions psychotiques peuvent être observées lorsque la drogue n'est plus consommée.

Il y a également un groupe de substances hallucinogènes qui sont contenus dans un petit cactus des régions semi-désetiques du Mexique.  La mastication de la partie aérienne découpée en disque provoque une sensation euphorique accompagnée d'hallucinations.  Cette activité est due à plusieurs alcaloïdes dont l'un d'eux est la mescaline.  L'utilisation du peyotl ou "boutons mescaliques" n'est pas seulement limité à l'Amérique centrale mais le cactus peyote Lophophora williamsii est cultivé occasionnellement en allemagne.

Un champignon mexicain produit également des effets hallucinogènes et contient de la psilocybine. Parmi d'autres substances hallucinogènes ont peu encore citer la dimethoxymethylamphétamine (STP), la dimethyltryptamine (DMT), la phencyclidine.

 

 

 

 

2.1.2.3.  La phencyclidine (PCP)

L'abus de Phencyclidine communément appelé PCP s'est développé dans des proportions alarmantes en raison du fait que cette drogue est synthétisée par des processus chimiques assez simples qui peuvent être reproduits dans des laboratoires clandestins.  Ces derniers peuvent être équipés de façon moderne ou simplement être localisé dans des garages ou des salles de bain.  Certains opérateurs ont les connaissances techniques permettant d' assurer des productions se rapprochant de productions commerciales.

La phencyclidine est souvent mélangée avec d'autres drogues comme le LSD ou des amphétamines et est vendue sous forme d'une poudre appelée poudre des anges (Angel dust) , sous la forme de capsules ou des tablettes.  Cette drogue peut être fumée, ingérée ou reniflée.  Suite à l'ingestion orale d'une dose modérée de 1 à 6 mg, le consommateur ressent un sentiment de force et d'invulnérabikité accompagné d'un sentiment songeur de détachement.  Néammoins, l'utilisateur peut rapidement devenir déprimé, irritable, avoir un sentiment de solitude, subir des phénomènes d'hallucinations dans le domaine de la perception sonore et visuelle et parfois l'utilisation de PCP est accompagné de paranoia.  Des dépressions sévères, des tendances à la violence et au suicide font suite à une utilisation à long terme.  Dans certains cas, l'utilisateur de PCP peut subir un comportement schizophrénique soudain des jours après l'ingestion de la drogue.  

Le PCP se lie avec une haute affinité à des sites situés dans le cortex blocquant des récepteurs du type  glutamate, l'acide N-methyl D-aspartique (NMDA).  Les opiacés type s et certaines autres drogues présentent une activité similaire à celle des PCP lors de l'utilisation de modèles animaux et se lient aux mêmes sites.  Ce n'est pas le cas du LSD.

2.1.3  Les Dépresseurs du système nerveux central     

2.1.3.1  L'alcool éthylique

De nombreuses personnes ne considèrent pas l'alcool comme une drogue, néammoins ses effets comportementaux majeurs découlent de son action dépressive sur le système nerveux central.  Aux Etat-Unis l'industrie de l'alcool produit environ 3,8 milliards de litre de spiritueux, vins, bières pour lesquels 90 millions de consommateurs paient 40 milliards de dollars.  L'alcool est donc la drogue dont on abuse le plus dans le monde.  Le comportement suite à une ingestion d'alcool varie avec la quantité absorbée et des résistances individuelles.  Lorsque l'alcool entre dans la circulation sanguine, il est transféré rapidement vers le cerveau ou il agit sur le contrôle de la pensée et sur la coordination musculaire.  Lorsque ingéré en doses modérées, l'alcool inhibe les processus de la pensée, de la parole et diminue la vitesse des réactions présentant un danger pour la conduite automobile.  De plus fortes doses d'alcool peuvent amener l'individu à devenir irritable, colérique et le fait que qu'un individu puisse se mettre à crier est souvent observé.  Des doses extrêmement élevées peuvent conduire l'individu dans un état d'inconscience et même dans un état comateux préludant d'une dépression fatale des fonctions circulatoires et respiratoires.

2.1.3.2  Les Barbituriques

Les barbituriques procurent un état relaxant, un sentiment de bien être et provoquent le sommeil.  Comme l'alcool, les barbituriques agissent sur le système nerveux central.  Les barbituriques peuvent être décrit comme des dérivés de l'acide barbiturique qui furent synthétisés par le chimiste allemand Adolf Von Bayer.  Les barbituriques sont des dérivés du 5,5-disubstitués du malonyl urée.  Vint cinq dérivés des barbituriques ont été utilisés dans la pratique médicale aux Etats-Unis mais cinq suffisent pour la plupart des applications médicales à savoir l'amobarbital, le secobarbital, le phénobarbital, le pentobarbital et le butabarbital.  Les consommateurs abusant de ces drogues les prennent par la bouche et la dose sédative moyenne est 10 à 70 mg.  Lorsque ingérée de cette façon, la drogue entre dans la circulation sanguine en traversant les parois du petit intestin,  Certains barbituriques comme le phénobarbital sont absorbés plus lentement que d'autres et sont classifiés pour cette raison comme des barbituriques à longue durée d'action.  C'est la lente action du phénobarbital qui rend compte de son faible usage comme drogue sujette à abus.  Les consommateurs de barbituriques préfèrent ceux à courte durée d'action comme le secobarbital, le pentobarbital et l'amobarbital.  Lorsque les quantités prescrites sont ingérées, les barbituriques sont relativement sans danger mais en cas de surconsommation pendant des périodes prolongées 

 

une dépendance physique peut se développer.  Lorsque des individus continuent à prendre de fortes doses de barbituriques un syndrome sévère de privation peut apparaître lorsque la drogue n'est plus ingérée.  Ceci peut résulter dans des insomnies, des spasmes musculaires, delirium et des convulsions.  

 

 

2.1.3.3  Les dépresseurs n'appartenant pas à la classe des barbituriques

Dans les années 1970, un dépresseur la méthaqualone (Quaalude) a été utilisé de façon illicite.  C'est un sédatif puissant et un relaxant musculaire possédant bon nombre des propriétés dépressives des barbituriques.  Depuis ce temps cette drogue a été placée sous contrôle strict et par le fait même son utilisation comme drogue sujette à abus a diminué.

Il y a environ 40 ans, il y a eu une augmentation forte dans l'usage des tranquillisants.  Bien que les tranquillisants puissent être considérés comme des dépresseurs , ils diffèrent des barbituriques dans la manière dont ils agissent sur le système nerveux central.  D'une façon générale ces drogues communiquent une tranquillité relaxante sans induire le sommeil.  Des tranquillisants majeurs comme la réserpine et la chlorpromazine (phénothiazines) ont été utilisés pour réduire l'anxiété et les tensions de patients souffrant de troubles mentaux.

Les Benzodiazépines ont été introduiites dans les années 1960 et ont pratiquement remplacés les barbituriques de la liste des drogues prescrites.  En raison de leurs effets secondaites moins nombreux et de leur toxicité plus faible, elles représentent une contribution innovatrice aux désordres psychiques.  Le problème lié à l'abus des benzodiazépines est bien connu et ces drogues peuvent produire une dépendance psychologique et physique lors de l'ingestion de fortes doses de façon répétée.  On peut estimer que 1 million de personne sont dépendantes des benzodiazépines en Allemagne seul..  Ceci signifie que ces drogues sujettes à abus viennent en troisième position après l'alcool et la nicotine.  Les benzodiazépines dont les polytoxicomanes abusent le plus sont le diazepam, le flunitrazepam et le bromazepam.  Le diazepam est la substance dont on abuse le plus parmi les benzodiazépines.  Elle est utilisée non seulement par des personnes qui essaient d'intensifier les effets d'autres drogues mais également par des alcooliques.  Le flunitrazepam est généralement utilisé par des polytoxicomanes qui s'adonnent également à l'héroïne, la cocaïne etc et qui consomment des quantités supérieures à 20 mg/jour.  Cette drogue est commercialisée sur le marché illicite comme une drogue dure et la combinaison avec l'héroïne et la cocaïne est connu sous le nom anglo-saxon de "speedball cocktail".

 

2.1.4  Les Stimulants  

Les amplétamines réprésentent un groupe de drogues synthétiques qui stimulent le système nerveux .  Généralement  des doses

thérapeutiques ordinaires de 5 à 20 mg par jour prises oralement procurent un sentiment de bien-être et de forme physique suivi par une diminution de la fatigue et une perte de l'appétit.  Ces bénéfices apparents sont cependant accompagnés par un état d'agitation et d'appréhensions et une fois que la drogue ne fait plus son effet de la dépression peut s'installer.  Aux Etats-Unis, les formes les plus sérieuses d'abus de la drogue sont l'injection intra veineuse (I.V) d'amphétamine ou de son dérivé chimique la méthamphétamine.  Le désir d'une expérience amphétaminique plus sérieuse est le motif primaire pour cette voie d'administration I.V.  La sensation initiale est un "flash" suivi par un sentiment intense de plaisir et pour y parvenir l'individu peut s'injecter de 500 à 1000 mg d'amphétamine toutes les 2 à 3 heures.  Des consommateurs utilisant abusivement cette drogue ont rapporté des états d'euphories produisant une hyper activité avec un sentiment d'une  vision claire accompagné d'états hallucinatoires.  Après l'effet, l'individu se sent très fatigué et peut dormir pendant un ou deux jours et par après peut encore subir une sévère dépression pouvant perdurer pendant des jours voire des semaines.  L'usage répété d'amphétamines conduit à une forte dépendance psychologique encourageant son administration continue.  Certains noms commerciaux rencontrés pour l'Amphétamine sont la Benzedrine et la Dexedrine, pour la Méthamphétamine la Mededrine et le Desoxyn.  Des drogues qui ont des propriétés pharmacologiques similaires à celles des amphétamines mais sans liens de structure chimique incluent la phenmetrazine et la phendimetrazine, deux drogues communément prescrites pour les contrôles de poids.

L'abus des drogues amphétaminiques et de ses dérivés ont repris un essor en partie grâce à la collaboration de scientifiques peu scrupuleux.  C'est notamment le cas de drogues du groupe de l'ectasy à savoir la 3,4-methylenedioxy-ethylamphetamine (MDE), la 3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA) et la 3,4-methylenedioxymethamphétamine ((MDMA = ectasy = XTC ).  Ces substances sont fournies sous la forme de tablettes de diverses dimensions , couleurs et densité.  Les consommateurs de drogues qui antérieurement consommaient des benzodiazépines en plus des drogues illégales dérivées des plantes (morphine, héroïne, cannabis, cocaïne) utilisent à présent des substances appartenant à ce groupe et leur diffusion n'a pas encore cessé.

La Cocaïne

La cocaïne est une drogue stimulante extraite des feuilles de Erythroxylon coca , une plante cultivée dans les Andes et en Asie. La cocaïne a eu des applications comme anesthésique local mais cette fonction a actuellement été remplacée par d'autres médicaments comme la procaïne et la lidocaïne.  La cocaïne est également un puissant stimulant du système nerveux central et ses effets ressemblent à ceux causés par les amphétamines à savoir une vigueur accrue accompagné par une suppression de la faim et de la fatigue.  Le plus souvent la cocaïne est reniflée et est absorbée dans le corps par les membranes muqueuses du nez. Une forme de la cocaïne qui gagne en popularité est le "crack" .Le procédé utilisé pour faire du "crack" est simple.  La cocaïne ordinaire est mélangée avec de la soude chaude et de l'eau pour en faire une solution qui est chauffée dans un récipient.  Le matériel est alors séché et cassé en petit morceaux que les revendeurs appellent le "crack".  Le crack est en fait la cocaïne sous sa forme base libre et est suffisamment volatile pour être fumée généralement dans des pipes en verre   Le crack lorsque reniflé fortement produit un sentiment d'euphorie accompagné par une sensation d'énergie accrue et de bien être mental.  Au plus la concentration en cocaïne s'élève dans le cerveau au plus grande l'euphorie et la façon la plus efficace d'obtenir cet effet est de fumer le crack.   Si apparemment il n'y a pas d'évidences de dépendance psychologique résultant de l'utilisation prolongée de la drogue, l'abstention après une utilisation prolongée peut conduire à de fortes dépressions mentales pouvant être une contrainte donnant lieu à la réutilisation de la drogue.  Les 75 % de la cocaïne vendue aux Etats -Unis a été raffinée dans des laboratoires clandestins en Colombie et les profits sont astronomiques. puisque le kilo de cocaïne est revendu aux Etats-Unis à environ 300.000 dollars.

 

3. Méthodes d'extraction des drogues (Préparation de l'échantillon)    

La préparation d’échantillon est une partie essentielle de l’analyse HPLC et de l’analyse LC-MS qui a pour but d’assurer l’homogénéité des solutions qui doivent pouvoir être injectées de façon reproductible sur une colonne.La préparation d’échantillon vise à permettre l’injection sur une colonne d’une portion aliquote de l’échantillon qui est relativement exempt d'interférence, qui ne va pas endommager la colonne et qui est compatible avec la méthode HPLC utilisée.  L'échantillon sera donc dissoud dans un solvant compatible avec la phase mobile.  Il peut aussi être nécessaire de concentrer les analytes et/ou de les dérivatiser afin d'améliorer la sensibilité de la détection et/ou la qualité de la séparation

  La préparation de l’échantillon commence au point de collection jusqu’au moment de l’injection de l’échantillon sur la colonne.

                                       TABLE 1.1  Options de Prétraitement de L’Echantillon

OPTIONS

COMMENTAIRES

1. Collection de L’Echantillon

 

 

 

2.  Stockage de l’échantillon et sa

     Préservation

 

 3.  Traitement préliminaire de l’échantillon

 

 

 

 4. Pesée ou dilution volumétrique

 

 

5.  Méthodes alternatives de préparation           de l’échantillon

 

6. Elimination des particules

 

 

7. Extraction de l’échantillon

 

 

8. Dérivatisation

 

Obtention d’un échantillon représentatif en utilisant des procédés statistiquement valables.

 

Utiliser des récipients appropriés inertes, bien fermés; être prudent avec des matériaux volatils, instables ou réactifs; les échantillons biologiques peuvent requérir la congélation.

 

L’échantillon doit être sous la forme requise pour un prétraitement plus efficace de l’échantillon (par exemple, séchage, tamisage, broyage etc); des échantillons finement dispersés sont plus facilement dispersés ou extraits.

 

Prendre les précautions nécessaires pour des matériaux réactifs, instables ou biologiques; pour diluer utiliser de la verrerie volumétrique calibrée.

Remplacement de solvant, enlèvement des sels, évaporation, lyophilation etc

 

 

 

 

Filtration, extraction en phase solide, centrifugation

 

 

Méthodes pour des échantillons liquides (tables 2.2) et solides (tables 2.3 et 2.4).

Utilisée principalement pour améliorer le détection de l’analyte et parfois pour améliorer la sépararation

Les options 1 à 4 incluant la collection de l’échantillon, le transport, le stockage, le traitement préliminaire de l’échantillon et son échantillonnage en laboratoire de même que les processus de pesée/dilution, constituent une partie importante de la préparation de l’échantillon. 

Les discussions qui nous préoccuperons relèveront principalement des options 5 à 8 de la table 1.1 qui englobent ce qui est généralement considéré comme le prétraitement de l’échantillon.

Tandis que l’HPLC peut être considérée comme un processus automatisé, le prétraitement de l’échantillon est souvent réalisé via un mode manuel.  Conséquemment, le prétraitement de l’échantillon peut requérir plus de temps pour le développement de la méthode qu’il n’en faut pour la mise au point de la séparation HPLC et l’analyse des données.

Finalement, la précision et l’exactitude de la méthode sont fréquemment influencées par le procédé de prétraitement de l’échantillon, incluant les opérations de pesée et de dilution.

Un  procédé de prétraitement de l’échantillon devrait fournir

  A) une récupération quantitative de l’analyte

  B) faire intervenir un nombre minimum d’étape

  C) dans la mesure du possible être facilement automatisé

  La récupération quantitative de l’analyte (plus de 99 %) augmente le sensibilité et la précision de la méthode bien que cela ne signifie pas que tout l’analyte présent dans l’échantillon doit être inclus dans l’échantillon final injecté.   Par exemple, pour une série d’étapes de prétraitement de l’échantillon, des aliquotes de fractions intermédiaires peuvent être utilisées pour une préparation ultérieure de l’échantillon ou pour une injection intermédiaire.  Si la récupération est plus petite que 100 %, le prétraitement de l’échantillon doit être reproductible.  Un plus petit nombre d’étapes de prétraitement de l’échantillon et un processus d’automatisation reduit le temps et l’effort requis et diminue la possibilité d’erreurs d’imprécision de l’analyste.

 

1.2  TYPES D’ECHANTILLONS  

  Les échantillons peuvent être classifiés comme étant de nature organique ( incluant les échantillons biologiques) ou inorganique et peuvent être subséquemment subdivisés en solides, semi solides (incluant les crèmes, les gels, les suspensions, les colloïdes), des liquides et des gaz. Les échantillons de gaz sont habituellement analysée par chromatographie en phase gazeuse plutôt que par HPLC. 

Nous ne considérerons ici que les cas les plus nombreux, c’est-à-dire le prétraitement des  échantillons les plus nombreux c’est-à-dire les analytes semi volatils et non volatils dans diverses matrices.

Comparés aux gaz ou solides, les échantillons liquides sont beaucoup plus facilement préparés pour l’HPLC.  De nombreuses analyse par HPLC sont basées sur un “ procédé de dilution “ ou la concentration de l’analyte solubilisé est réduite par dilution pour éviter une surcharge de la colonne ou une saturation du détecteur. La préparation de l’échantillon pour des échantillons solides peut être plus contraignantes.  Dans certain cas, l’échantillon est facilement dissout et alors prêt pour des injections ou un traitement ultérieur.  Dans d’autres cas, la matrice peut être insoluble dans les solvants usuels et les analytes doivent être extraits de la matrice solide.  Il y a aussi des cas ou les analytes ne sont pas facilement déplacés de la matrice insoluble en raison de phénomènes d’inclusion ou d’absorption.

Dans ce cas des techniques plus rigoureuses peuvent être nécessaires comme

A) l’extraction par Soxhlet

B) l’extraction par fluide supercritique (SFE)

C) l’ultrasonication

D) L’extraction solide-liquide.

  La table 1.2 donne la liste des méthodes traditionnelles pour la récupération d’analyte à partir d’échantillon solide et la table 1.3 décrit certaines des méthodes les plus récentes.

Une fois que les analytes ont été quantitativement extraits d’un échantillon solide, la fraction liquide résultants peut être soit injectée sur une colonne HPLC ou soumise à un prétraitement ultérieur.

                 TABLE 1.2  Méthodes d’extraction traditionnelle pour des échantillons solides

Méthodes de Prétraitement de l’échantillon

Principes de la technique

Commentaires

Extraction Solide-Liquide

 

 

 

 

 

 

 

 

  Extraction au Soxhlet

 

 

 

 

 

 

Homogénéisation

 

 

 

 

 

 

 

 

Sonication

 

 

 

 

 

 

 

Dissolution

 

L’échantillon est placé dans un récipient fermé et le solvant est ajouté pour dissoudre l’analyte recherché

 

 

 

 

  L’échantillon est placé dans un container poreux à usage unique et du solvant qui est reflué passe à travers la cartouche contenant l’échantillon et retourne dans un ballon récepteur enrichi de l’analyte et ceci de manière cyclique.

 

 

 

L’échantillon est placé dans un mélangeur, le solvant est ajouté et l’échantillon et homogénéisé pour donner une poudre finement divisée, le solvant est enlevé pour permettre un traitement ultérieur.

 

 

 

Un échantillon finement divisé est immergé dans un bain à ultra-son avec du solvant et est soumis à des radiations dans le domaine de l’ultra-son.  Une sonde à ultra-son peut être également utilisée.

 

 

 

 

L’échantillon est traité avec un solvant de dissolution

Cette extraction se fait souvent à reflux pour améliorer la solubilité; l’échantillon se trouve dans un état finement divisé afin d’augmenter la surface spécifique; l’échantillon peut être filtré , décanté ou centrifugé pour séparer le solide insoluble.

 

L’extraction se fait dans un solvant pure, l’échantillon doit être stable au point d’ébullition du solvant.  Les récupération sont en général excellente et cette méthode est utilisée comme standard pour comparer d’autres méthodes d’extraction solide.

 

 

Utilisé pour les plantes et le tissu animal, les aliments, des échantillon en provenance de l’environnement; des solvants organiques ou aqueux peuvent être utilisés, de la glace ou de  peut être utilisée

 

 

 

 

La dissolution est aidée par le processus à ultra-son, la chaleur peut améliorer l’extraction, requis pour des matériaux bruts et granuleux.

 

 

 

 

Des solides inorganiques peuvent nécessiter des acides ou des bases

 

 

       TABLE 1.3 Méthodes d’extraction modernes des échantillons solides

 

Méthodes de prétraitement de l’échantillon

Principe de la technique

Commentaires

Extraction par solvant accélérée (ASE)

 

 

 

 

 

 

 

 

  Extraction par fluide supercritique

 

 

 

 

 

 

  Extraction assistée par microondes

 

 

 

 

 

L’échantillon est placé dans un container scellé et chauffé au-dessus de son point d’ébullition, provoquant une augmentaion de la pression dans le récipient; l’échantillon extrait est prélevé directement et transféré dans un récipient pour traitement ultérieur

 

 

 

L’échantillon est placé dans un container dans lequel passe un fluide supercritique (p.e, CO2 ), après dépressurisation l’échantillon extrait est collecté dans un solvant ou pepris sur un adsorbant suivi d’une désorption par élution avec un solvant.

 

L’échantillon est placé dans un récipient ouvert ou fermé et est chauffé par transmisson d’énergie micro-onde provoquant l’extraction de l’analyte dans le solvant .

Augmentation de la vitesse du processus d’extraction liquide-solide; automatisé, le récipient doit résister à de hautes pression; l’échantillon extrait est dilué et requiert une concentration ultérieur.

 

 

 

 

 

 

Versions manuelles et automatisées disponibles.

 

 

 

L’extraction par solvant peut être type absorbant les microondes (MA) ou n’absorbant pas les microondes (NMA).  En MA, l’échantillon est placé dans un container haute pression et chauffé bien au-dessus du point d’ébullition comme pour ASE.

 

1.3 Traitement préliminaires d’échantillons solides ou semi-solides   

  1.3.1  Réduction de la grandeur particulaire de l’échantillon

  1.3.2  Séchage de l’échantillon

  1.3.3  Filtration

1.4  Prétraitement de l’échantillon pour les échantillons liquides

  1.4.1  Extraction liquide-liquide (LLE) 

  1.4.1.1  Théorie  

                  La loi de distribution de Nernst spécifie que tout composé sera distribué entre deux solvants immiscibles de telle façon que le rapport des concentrations reste constant

                                                       ou  KD   est la constante de distribution

           Co    La concentration de l'analyte dans la phase organique

           Caq  La concentration de l'analyte dans la phase aqueuse

                              

La fractioin de l'analyte extrait (E) dans la phase organique est donné par l'expression suivante :

  

 

 

ou Vo est le volume de la phase  organique

      Vaq le volume de la phase aqueuse

   et V le rapport des phases  Vo/Vaq

   

 

 

 

1.4.1.2  Pratique

  1.4.1.3  Problème

  -Formation d’émulsion

- Analytes fortement absorbés aux particules

-Analytes liés à des composés de hauts poids moléculaires (p.e médicaments aux protéines)

- solubilité mutuelle des deux phases

 

1.4.2 Extraction SPE  

  1.4.2.1.  SPE vs LLE   L’extraction phase solide est la technique la plus importante utilisée dans le prétraitement de l’échantillon pour l’HPLC.  La SPE peut être utilisée de façon similaire à la LLE.  Tandis que la LLE est un procédé de séparation en un stade, la SPE est un procédé chromatographique qui ressemble l’HPLC et présente certains avantages potentiels par rapport à la LLE :

  - Extraction plus complète de l’analyte

- Séparation plus efficiente des interférences

- Consommation réduite en solvant organique

- Collection plus facile de la fraction d’analyte totale.

- Procédures manuelles plus faciles

- Elimination des particules

- Plus facilement automatisable.

  En raison du fait que la SPE est une méthode de séparation plus efficace que la LLE , il est plus facile d’obtenir, en principe, une récupératioin plus élevée de l’analyte. .Les procédés LLE qui nécessitent plusieurs extractions successives de l’analyte afin de récupérer plus de 99 % de l’analyte peuvent souvent être remplacées par des méthodes SPE en une étape.

Avec la SPE il est souvent possible d’obtenir une élimination plus complète des interférences liées à la fraction de l’analyte.  Les techniques SPE en phase inverse sont les plus populaires, et seulement de petites quantités de solvant organique sont requis pour l’élution  tout en maintenant une haute concentration en analyte. 

En raison du fait qu’il n’y a pas de nécessité de séparation de phase en SPE, la fraction d’analyte total est aisément collectée, éliminant les erreurs associées avec des volumes extraits variables ou mesurés de façon imprécises.

Finalement, les particules les plus grandes sont arrêtées par la cartouche SPE et ne sont pas entraînées avec la fraction analyte.

  Quelques désavantages de l’SPE vs LLE incluent:

  - La variabilité des cartouches SPE

- L’adsorption irréversible  de certains analytes sur des cartouches SPE

  Les solvants utilisés en LLE sont généralement pures et bien-définis, si bien que les séparations LLE sont tout à fait reproductibles.  Inversément , les cartouches utilisée en SPE tendent à varier de lots à lots, si bien que la méthode de reproductibilité poser parfois probable avec les procédés SPE.  Les aires de contact sont plus plus importants pour les cartouches SPE et pour cette raison des liasons irréversibles de l’analyte (avec pour conséquence des récupération faibles est moins probable avec la LLE qu’avec la SPE.

 

1.4.2.2  SPE vs HPLC

Dans sa forme la plus simple, la SPE emploie une petite colonne en plastique à usage unique remplie avec 0.1 à 0.5 g d’adsorbant, une cartouche.  L’adsorbant  est communément un matériau en phase inverse (p.e de la silice C18) et une phase SPE en phase inverse (RP-SPE) ressemble à la fois la LLE et l’HPLC en phase inverse dans ses caractéristiques de séparation. La phase inverse est maintenue dans la cartouche par un fritté comme pour une colonne HPLC.  La grandeur particulaire (>40 µm) est plus grande que celles rencontrée pour des colonnes HPLC (3 à 10 µm). En raison de la longueur du lit de colonne, de la grandeur particulaire et d’un lit moins bien compacté, les cartouches SPE sont moins efficientes (N< 100) que les colonnes HPLC.  En raison du coût, un packing de forme irréguliere (plutôt que des particules sphériques) sont généralement utilisées en SPE.

Certaines cartouches SPE utilisent cependant les packings SPE shériques de 7 µm les plus chers.  D’une manière générale, les principes de la séparation , la sélection de la phase et la méthode de développement pour l’SPE sont similaires à celles  de l’HPLC.

Une différence majeure entre la SPE et l’HPLC est que la cartouche SPE est à usage unique et éliminée puisque des interférencers potentielles peuvent subsistées au sein de la cartouche.

   En SPE, un échantillon liquide est ajouté à la cartouche et un solvant de lavage est choisi de telle façon que l’analyte est soit fortement retenu (k>>1) ou non retenu (k=0).

Lorsque l’analyte est fortement retenu, les interférences sont éluées ou lavées de la cartouche afin de minimaliser leur présence dans la fraction de l’analyte finale.  L’analyte est alors élué dans un petit volume avec un solvant d’élution polaire., collecté et soit

A)  injecté directement sur une colonne HPLC

B)  évaporé à sec et dissoud dans une phase mobile HPLC.

 

Lorsque l’analyte est faiblement retenu, les interférences sont fortement retenues sur la cartouche et l’analyte est collecté pour un traitement ultérieur.  Pour les deux approches les interférences peuvent éliminées de l’analyte présentant un intérêt.

L’opération SPE complète sera expliquée ultérieurement.

 

1.4.2.3. Utilisation de le SPE 

 La SPE est utilisée en vue de couvrir six buts principaux dans la préparation de l’échantillon

- Elimination des interférences et de produits pouvant abimer les colonnes (column killers)

- Concentration ou enrichissement de traces de l’analyte

- Elimination des sels

-Echange de solvant

-Dérivatisation in situ

-Sample storage and transport

  Les interférences qui recouvrent des pics de l’analyte dans la séparation HPLC compliquent la méthode de développement et peuvent affecter défavorablement les résultats de l’essai.  Dans certains cas, un grand nombre d’interférences dans l’échantillon original peuvent rendre impossible la séparation de ces interférences de plusieurs pics de l’analyte en une seule séparation HPLC.  La SPE peut être utilisée pour éliminer ces interférences. Des tueurs de colonnes telles que des substances hydrophobes comme les acides gras , huile et graisses des substances polymères et des particules qui peuvent bouchés ou désactivés la colonne HPLC peuvent souvent être éliminés par la RP-SPE .

    La SPE peut être utilisée pour augmenter la concentration de traces de composants.  Si une cartouche SPE est choisie de telle façon que k>>1 pour l’analyte, un volume relativement important de l’échantillon peut être appliqué avant que l’analyte ne puisse saturer la cartouche et commence à eluer de la cartouche..  Le résultat net est une augmentation considérable dans la concentration de l’analyte lorsque il est élué avec un solvant fort (k<1) ce qui signifie une augmentation dans la sensibilité de la détection (appelé enrichissement de traces).  Un exemple de l’enrichissement de traces est l’utilisation de la SPE pour concentrer de faibles concentrations en hydrocarbures polycycliques ou pesticides d’échantillon aqueux de l’environnement en utilisant des cartouches SPE en phase inverse.

Un solvant polaire (p.e ACN et MeOH) élue ces analytes de la cartouche en un petit volume concentré, ce qui diminue le temps d’évaporation.  L’échantillon peut alors être redissoud dans un solvant compatible avec une séparation HPLC subséquente.

Alternativement, un solvant miscible de plus faible polarité  peut être ajouté à l’éluabt SPE afin de diluer le solvant le plus polaire et permettre une dilution directe de l’échantillon résultant.

     La RP-SPE peut être utilisée pour enlever les sels d’échantillons, spécialement avant la chromatographie HPLC par échange d’ions.  Les conditions de pH et de % de phasee organique sont choisis de telle façon à retenir initialement l’analyte, ce qui permet de laver les sels inorganiques de la cartouche avec de l’eau.  L’analyte peut être élué exempt de sel avec un solvant organique.

    La dernière application de la SPE (échange de solvant, dérivatisation in situ et stockage/transport de l’échantillon est plus rarement utilisé.

 

1.4.2.4  Dispositifs  SPE   

Plusieurs dispositifs sont utilisés por la SPE

1.  La cartouche

2.  Le disque

3.  La fibre traitée

 

1.4.2.4.1  La cartouche

  La configuration la plus populaire pour la SPE est la cartouche à usage unique (format seringue-cylindre) est illustré dans la figure 1.1.  Le cylindre de la cartouche est habituellement en polypropylene à usage médical choisi pour sa pureté.  Si des traces d’impureté telles que des plastifiants, des stabilisants ou des agents de démoulage sont présents dans le plastique, ils peuvent être extraits durant le processus SPE et contaminé l’échantillon.  La sortie de la cartouche est munie d’un embout conique (embout de Luer) permettant d’y fixer une aiguille afin de mieux permettre à l’effluent d’être canaliser dans un récipient collecteur.  Les filtres poreux maintenant le lit de particule dans la cartouche sont en polypropylene ou en acier inoxydable avec une porosité de 10 à 20 µm afin d’offrir une faible résistance à l’écoulement. Les cartouches SPE peuvent varier dans leur design afin de pouvoir être utilisée dans des instrumentations automatisées.

Des cartouches en verre ou PTFE sont disponibles pour les analyses des ultra-traces (ppb) lorsque les cartouches standard en plastique produisent des concentration inacceptables d’interférences extraites.  Les carouches SPE sont relativement peu chères si bien qu’elles sont utilisées une seule fois et éliminées en raison du danger de contamination croisée d’échantillons.

     Afin de couvrir une large gamme d’applications SPE, les cartouches sont également disponibles avec des volumes de réservoirs de 0.5 à 10 ml avec des packing allant de 35 mg à 2g.  Pour des échantillons très grands, il existe des macro-cartouches avec des packing de 10g et des réservoirs de 60 ml.  Des cartouches avec un grand réservoir sontb en prin,cipe utilisée pour des échantillons sâles qui peuvent saturer des cartouches de plus faible contenance.  Cependant des cartouches contenant 100 mg de packing ou moins sont préférées pour des échantillons liquides relativementy propres ou la capacité de la cartouche ne pose pas un problème.  Dans la plupart des cas il est préférable de collecter l’analyte dans le volume le plus petit possible (analyse à l’état de traces) ce quk signifie que la cartouche SPE doit être aussi la plus petite possible.

 

1.4.2.4.2  Le disque

  La seconde configuration la plus populaire en SPE  qui combinent les avantages des membranes et de l’extraction en phase solide.  Les disques de par leur apparence ressemblent étroitement aux filtres à membrane; ils sont plats généralement 1 mm ou moins en épaisseur avec des diamètres variant de 4mm à 96 mm

  Le packing pour les disques SPE représentent de 60 % à 90 % du poids total de la membrane. Certains disques sont vendus individuellement et doivent être installé dans un réceptacle réutilisable.  D’autres types de disques sont vendus pré-chargés dans des réceptables à usage unique ou des cartouches avec un embout de Luer permettant une connexion facile à des seringues et aiguilles.   La construction physique de disques SPE diffèrent des filtres à membranes.  Les disques SPE consistent en

 

 

 

 

Un reseaux flexible ou expansés PTFE rempli avec un packing de silice ou de résine

  -  Des disques en fibres de verre rigides avec un matériau qui y est imbriqué

  - Un packing imprégné de chlorure de polyvinyl   

  - Des membranes dérivatisées

 

Les disques SPE  et les cartouches diffèrent principalement dans leur rapport longueur/diamètre (L/d):  les disques ont un rapport L/d < 1 et les cartouches un rapport L/d >1.  Comparés aux cartouches SPE , ces caractéristiques des disques permettent un débit plus important et une extraction plus rapide (Table 1.4)  Par exemple, 1L d’eau relativement pure peut passer à travers un disque de diamètre 45 mm en approximativement 15 à 20 min, tandis que deux heures sont nécessaires pour passer au travers du lit d’une cartouche de 15 x 8 mm .

 

      Table 1.4  Comparaison d’une cartouche typique et d’un disque typique pour la SPE

 

Paramètres

Cartouche

Disques

Dimensions (hauteur et diamètre)

 

Surface

 

Poids du packing

 

Débit à 85 kPa

 

Vélocité linéaire

1.1 x 1.1 cm

 

 0.95 cm2                         

 

500 mg

 

30 mL/min

 

0.525 cm/s

0.05 x 4.7 cm

 

 11.34 cm2

 

500 mg

 

100 mL/min

 

0.15 cm/s

          

De l’eau sâle ou de l’eau contenant des particules, comme de eaux usées, peuvent boucher le disque poreux comme pour les cartouches.  Dans chacun des cas, la préfiltration doit être utilisée avant le traitement SPE dans le cas ou l’échantillon contient un nombre non négligeable de particules.  La formation de canaux, qui provoque des caractéristiques d’écoulement inégales avec une récupération d’analyte plus faible, peut survenir avec certaines cartouches.  En raison du fait que le packing est noyé dans une matrice,  la formation de canaux est inexistante avec des disques.  Cependant, en raison de l’épaisseur du film ( typiquement de 0.5 à 2 mm ), des composés avec une valeur de k faible tendent à avoir des volumes de percées plus faible que les cartouches SPE.

    Les disques SPE ont été trouvés utiles pour des applications d’environnement telles que des analyses de traces organiques dans les eaux de surface, qui souvent nécessitent un grand volume d’échantillon pour obtenir la sensibilité. L’agence pour la protection de l’environnement des Etats-Unis (US EPA) a approuvé la technologie SPE comme une alternative aux extractions liquide-liquide pour la préparation d’échantillon aqueux pour l’analyse HPLC.  Des exemples de méthodes approuvées comprennent des procédures pour

 

A) les phénols

B) les pesticides et les biphényls polyclorés (PCBs)

C) les acides haloacétiques dans l’eau potable.

D) les pesticides organochlorés dans les déchets solides.

 

Un avantage majeur de la SPE par rapport aux méthodes d’extraction liquide conventionnelles est la consommation réduite de solvants organiques.  Les disques SPE et les cartouches nécessitent seulement que quelques millilitres de solvant par essai comparés à des centaines de millilitres pour une séparation multi-étape LLE.

   Des disques en fibres de verre rigide contenant de 1.5 à 30 mg de packing sont utiles pour le prétraitement de petits échantillons cliniques (plasma ou sérum) .  Ici, l’avantage de ce type de disque est l’obtention d’extrait plus propre dû à un volume d’élution de solvant réduit, à moins d’interférences provenant de composés retenus faiblement et à l’absence de filtres poreux qui sont des sources possibles de contamination.

 

Des disques imprégnés de materiaux en chlorure de polivinyle (PVC) fournissent des possibilités similaires aux disques PTFE.  Ces  membranes présentent des pores de 1µ à l’écoulement qui permettent des separations rapides.  Bien qu’utilisé pour la purification des protéine, ces disques pour d’autres applications SPE pour peu que le solvant utilisé soit compatible avec le PVC.  Il n’y a pas un si grand nombre de phases stationnaires disponibles (p.e échange d’ions et affinité) pour les disques PVC que pour les disques et cartouche PTFE.

 

Les membranes derivatisées diffèrent des disques imprégnés d’un adsorbant en ce que les membranes sont fonctionnalisées par des réactions chimiques.  Ces unités sont faites de cellulose dérivatisées avec des groupes comme le deithylaminoethyl (DEAE), un ammonium quaternaire (QAE) et le sulfonyl propyl (SP) et sont pour cette raison dans le mode échange d’ions.

 

1.4.2.4.3  Microextraction en Phase Solide (SPME)    

  Les fibres  traitées sont utilisées pour la microextraction en phase solide (SPME).  Dans cette présentation  une fibre fine, solide, en silice fondue est traitée avec une phase stationnaire polymérique telle que le polydimethylsiloxane ou le polyacrylate.  La fibre est trempée dans la solution à analyser et les analytes diffusent et se partitionnent dans le support polymérique en fonction de leur coefficient de distribution.  La fibre est retirée de la solution et placée dans la porte d’injection de la valve HPLC où les analytes sont déplacés avec un solvant fort, situation analogue à celle de l’étape d’élution pour les cartouches ou les disques SPE.

 

 

 

 

 

1.4.2.5  Instrumentation SPE  

               L’équipement nécessaire pour  réaliser de la SPE peut être très simple (Fig. 1.5).  La gravité pourrait être utilisée comme la seule force effectrice mais l’écoulement à travers la cartouche serait extrêmement lent rendant la méthode inutilisable dans le cas d’un usage général.  Ainsi le système de base le plus utile  utilise une seringue pour faire passer le solvant ou l’échantillon à travers la cartouche.  Cette méthode peut être difficile si l’échantillon est visqueux ou contient des particules.  Dans ce cas une fiole à vide pouvant recevoir une carouche peut être utilisée .  Lorsque plusieurs échantillons doivent être manipulés simultanément, un système de collection multiple sous vide afin de traiter plusieurs cartouches simultanément  est recommandé

 Un portoir qui peut être déplacé est situé à l’intérieur de l’appareillage de collection sous vide servant à maintenir les tubes en position verticale lors de la collection.  Afin d’assurer un meilleur contrôle de l’écoulement du solvant, dans certaine unité des valves de contrôle de l’écoulement et une jauge sont incorporées.  Dans les unités les plus sophistiquées, des contrôle individuel pour chaque cartouche sont fournis afin d’assurer une distribution de l’écoulement bien uniforme entre les cartouches.  Finalement une fiole à vide munie d’une entrée latérale est placée entre le système collecteur sous vide et la source de vide afin de collecter les solvants de rinsage et de lavage.  Indépendemment de la méthode utilisée pour forcer l’échantillon à travers la cartouche SPE ou autre systeme SPE , le débit ne doit pas être trop rapide puisqu’il pourrait y avoir un temps de contact insuffisant de l’échantillon avec la phase stationnaire.  Pour des applications SPE typiques, un débit de 10 ml/min ou moins est recommandé pour la plupart des cartouches et 50 ml/min pour les disques de 90 mm .

    Lorsque le nombre d’échantillon augmente, il, est possible d’automatiser le processus dans son entièreté.  Il y a trois approches fondamentales à l’automatisation SPE:

1) L’équipement SPE dédié

2) Systèmes de manipulation liquide modifiés.

3) Des stations de travail robotisées.

L’instrumentation la plus simple et la moins chère est l’équipement SPE dédié qui assure le conditionnement, le lavage et l’élution.  De telles systèmes peuvent utilisés des cartouches standards, des cartouches spécialement étudiées l’instrumentation utilisée ou des disques SPE. 

Des systèmes de manipulation liquide modifiés sont utilisés principalement pour réaliser des fonctions de dilution, de mélange, et l’addition d’un standard interne.  Plusieurs appareillage commerciaux assurent une SPE automatisée.

Les systèmes robotiques sont les plus versatiles dans les fonctions d’assistance à la préparation d’échantillons.  Il est généralement plus avantageux d’interfacer le robot à une station de travail SPE dédiée et le robot sert alors à déplacer les échantillons contenus dans des récipients vers ou de la station de travail dédiée et également vers ou de systèmes de préparation d’échantillon (e.g balances, méalngeurs, dilueurs, colecteurs d’échantillons situés sur la table de laboratoire.

 

1.4.2.6  Développement de méthodes SPE  

            Vue d’ensemble de la séparation SPE  

L’application de la méthode SPE fait intervenir d’une manière générale quatre étapes.

 1. Le conditionnement du packing.

2.  L’application de l’échantillon

3.  Le lavage du packing (élimination d’interférences)

4. La récupération de l’analyte

 Dans cette discussion il est supposé que l’opérateur utilise la RP-SPE et que l’analyte est retenu initialement.  

Dans l’étape 1 exécuté avant l’addition  de l’échantillon, le packing est conditionné par passage à travers la cartouche de plusieurs volumes  de solvant , typiquement du méthanol ou de l’acétonitrile.  Le rôle de l’étape de conditionnement est double:

A) elle enlève les impureté qui aurait pu être collectées lorsque la cartouche est exposée à l’environnement du laboratoire

B) permet à l’adsorbant d’être solvaté.  La solvatation est importante en raison du fait que le packing RP-SPE (spécialement les C8,C18 et phenyl) qui sont dans un état déseché présente souvent des temps de rétention diminué. De plus différents états de dessication conduisent souvent à des récupérations d’analytes non-reproductibles.  Le méthanol est communément utilisé comme solvant de conditionnement pour les packings RP-SPE ou des phases liées polaires comme les cyano, amino et diol.  Cependant, le méthanol ne doit pas être utilisé pour le silica gel qui est fortement désactivé par ce solvant, un solvant de polarité intermédiaire doit être utilisé pour la silice non modifiée comme le dichlorométhane. 

Avec les séparations RP-SPE, l’élimination d’un excès de méthanol peut être assurée en purgeant la cartouche avec un solvant miscible avec le solvant de conditionnement par ex. de l’eau ou un tampon). Un préconditionnement à l’eau peut aussi servir à préparer la cartouche pour l’introduction d’un échantillon aqueux.

 

Etape 2

Elle comprend l’application de l’échantillon qui est dissoud dans un solvant de faible polarité et qui est ajouté à la cartouche.  Ce solvant de faible polarité permet une forte rétention de l’analyte.  Pour la RP-SPE , un solvant faible est l’eau ou un tampon avec jusqu’à 10 % de solvant organique.  Pour les échanges d’ions, un solvant similaire est acceptable, mais la force ionique de l’échantillon en solution doit être aussi faible que possible. .L’échantillon pour SPE peut être appliqué avec une pipette ou seringue, ou pompé dans la cartouche. Cette dernière méthode est plus facile pour des volumes importants d’échantillon (> 50 ml)  tel que des échantillons d’eau prélévés dans l’environnement.

L’échantillon et la grandeur de la cartouche doivent être adaptés de telle façon à ne pas dépasser la capacité de la cartouche.  La solution de l’échantillon est passée à travers la colonne sans lui laissé le temps de sécher.  Le débit est généralement ajusté en réglant le vide et des débits de 2 à 4 ml/min sont en général acceptables.

   Etape 3-4

 Elle assure l’élimination des interférences par lavage de la cartouche avec un solvant W de polarité intermédiare.  Idéalement, le lavage est stoppé avant que l’analyte ne commence à sortir de la colonne, de cette façon les interférences qui sont plus faiblement retenues que l’analyte sont éliminées de la cartouche sans perte d’analyte.

De l’eau ou un tampon est souvent utilisé pour le solvant de lavage en RP-SPE mais ceci ne guaranti pas nécessairement l’élimination maximale des interférences de la fraction analyte qui est collecté dans l’étape 5.  Une petite quantité contrôlée de solvant organique peut être ajoutée à la solution de lavage pour faciliter l’élimination de substances plus hydrophobes.  Il est nécessaire de prendre les précautions nécessaires afin que l’analyte ne soit pas éliminé en même temps.  En raison de la variabilité de la séparation SPE de cartouches à cartouches, une marge de sécurité dans le volume de la solution de lavage utilisée pour éliminer les interférences de la cartouche.  Le but ultime est une récupération de 100 % de l’analyte dans l’étape 4 (Fig. 1.6d); sinon des récupérations variables risquent de se produire.

  Etape 5  

Elle assure l’élution et la collection  de la fraction analyte.  Si la sensibilité à la détection est un but majeur, l’analyte sera collecté dans le plus petit volume possible.  Ceci peut être réalisé avec un solvant d’élution polaire E, si bien que k=0 pour l’élution de la bande d’analyte.  Alternativement, l’utilisation d’un solvant moins polaire E qui assure l’élution de l’analyte (p.e k=1) va minimiser l’élution de substances interférentes retenues plus fortement.  Ceci est important lorsque des substances à élution tardives sont présentes dans des quantités significatives puisque ces composée peuvent accroître le temps requis pour l’analyse HPLC.   Si un solvant d’élution E de polarité intermédiaire est utilisé avec comme conséquence un grand volume pour la fraction analyte, il est toujours possible d’évaporer l’éluant à sec et de redissoudre l’analyte dans la phase mobile HPLC afin de réduire le volume final de la fraction analyte.  L’évaporation à sec est souvent requise puisque l’élution du solvant E pour la SPE peut être un solvant trop polaire pour une séparation HPLC subséquente.

    Il est souvent désirable de collecter la fraction analyte dans un solvant d’élution qui sera une phase mobile de faible polarité pour une séparation HPLC subséquente.

Si l’analyte est un acide ou une base , le pH de l’échantillon peut être ajusté pour supprimer l’ionisation de l’analyte et optimaliser la rétention RP-SPE dans les étapes 2 et 3 (Fig. 1.6 b et c).  L’élution de l’analyte dans l’étape 4 (Fig. 1.6d) peut être effectuée par un changement de pH de telle façon à ioniser l’échantillon et réduire son temps de rétention.  Après avoir collecté la fraction analyte, le pH de la fractionpeut être réajusté pour obtenir une rétention optimum dans la séparation HPLC subséquente.

     Une seconde approche est l’utilisation d’un packing de colonne SPE de faible polarité (cyano ou une chaine alkyl courte) si bien que le solvant d’élution ne doit pas être d’aussi forte polarité.  Dans ce cas, une colonne HPLC de plus forte polarité (p.e C18) doit être utilisée pour doser la fraction SPE.

 

Les Phases SPE 

En raison du fait que la SPE est une adaptation à basse efficience de l’HPLC, de nombreuses phases utilisées en HPLC sont disponibles en versions SPE.

          Phases               Phase Inverse              Caractéristiques
Octadecyl (C18) - (CH3)17-CH3 17 % C
Octyl (C8) -(CH2)7-CH3 14 % C
Ethyl (C2) -(CH2-CH3) 4,8 % C
Cyclohexyl -CH2-CH3-cyclohexyl 12 % C
Phenyl -CH2-CH2-CH2-Phenyl 10,6 %
Copolymère Styrène-divinylbenzène  
                 Normal Phase  
Cyano (CN) -(CH2)3-CN 10,5 % C, 2,4 % N
Amino(NH2) -(CH2)3NH2 6,4% C, 2,2 % N
Diol -(CH2)3OCH2CH(OH)CH2OH 8,6 % C
Silica gel -SiOH  
Florisil Mg2SiO3  
Alumina Al2O3  
              Echangeurs d'ions  
Amino(NH2) -(CH2)3NH2 1,6 meq/g
Amine quaternaire -(CH2)3N+(CH3)3 0,7 meq/g
Acide carboxylique -(CH2)3COOH 0,4 meq/g
Acide sulfonique aromatique -(CH2)3-Phenyl-SO3H 1,0 meq/g
          Exclusion  
Large pore hydrophobe (butyl) -(CH2)3CH3 5,9 % C
Echangeurs d'ions large pore -COOH 12,2 % C
  Phases communes disponibles en SPE  

La table ci-dessus liste les phases SPE les plus populaires et les types d’analytes retenus par ces dernièressont donnés dans un autre tableau . 

                                                                              Guide d'Application SPE 

                       Phases Applications
C-18 une des phases les plus hydrophobes en phase inverse, Isolement d'espèces hydrophobes en solution, drogues dans le sérum, plasma et urine, Enlèvement de sels dans les peptides, acides organiques dans le vin, pesticides dans l'eau par enrichissement de traces.
Copolymère styrene-divinylbenzène Enrichissement de traces de pesticides polaires dans l'eau et isolement de métabolites de médicaments à caractère polaire.
C-8 Phase inverse hydrophobe , isolement de composés hydrophobes à partir se solutions aqueuses, médicaments présents dans le sérum, le plasma et l'urine, peptides sériques et plasmatiques.
Silice Phase normale polaire neutre, isolement de composés de polarité faible à modérée à partir de solutions aqueuses, classification de lipides, séparation de pigments des plantes, pesticides extraits du sol et de résidus alimentaires.
Florisil Phase normale basique légèrement polaire, isolement de composés à polarité modérée à partir de solutions aqueuses, pesticides alimentaires, biphenyl polychlorés dans les huiles, pesticides extraits du sol et résidus alimentaires
Alumine A Phase normale polaire acide, isolement de composés hydrophiles à partir de solutions aqueuses, échangeurs d'ions de basse capacité, sucre et cafféine dans des boissons, additifs alimentaires.
Echangeur de cations Phase échangeur de cations, isolement d'analytes cationiques en solution aqueuse et non aqueuse, fractionnement de protéines faiblement basiques et d'enzymes.
Echangeur d'anions Phase échangeur d'anions, isolement d'analytes anioniques en solution aqueuse et non aqueuse, extraction de protéines acides et faiblement acides et d'enzymes, enlèvement de pigments acides de vins, de jus de fruit et d'extraits alimentaires, enlèvement d'acide organique présent dans l'eau.
Mode mixte Phase inverse (C8) et phase échangeuse de cations, isolement de médicaments basiques et d'amphotères à partir du sérum, du plasma et de l'urine.
Aminopropyl, NH2 Phase normale, phase inverse et faible échangeur de cations, médicaments et métabolites à partir des fluides biologiques, fractionnement de pétrole et d'huile, phénols et pigments végétaux.
Cyanopropyl,CN Phase normale et phase inverse, analytes dans des solvants aqueux et organiques.
Diol, OH Phase normale et inverse, analytes en solution aqueuse et organique, médicaments et métabolites dans des fluides biologiques.

Les silices liées sont les plus souvent utilisées mais d’autres matériaux inorganiques et polymériques sont commercialement disponibles.  En plus des phases répertoriées  des phases spéciales sont disponibles pour les aldéhydes et cétones présentes dans l’air, pour l’isolement dans l’urine de drogues soumises à abus, et pour les catecholamine dans le plasma.  Le Florisil qui est un silicate de magnésium activé et l’alumine sont utilisées plus fréquemment en SPE qu’en HPLC et par exemple des méthodes publiées utilisant le Florisil existent pour l’isolement de pesticides.

     Les packings des cartouches SPE sont de qualité et d’un coût moindre que les phases correspondantes HPLC et ceci contribue au problème de la variabilité entre batch. Tandis que les phases de remplissage basique de colonne avec des intéractions minimales de groupes silanols sont préférées en HPLC en phase inverse, les packings pour pour les RP-SPE sont généralement plus acides et les intéractions des groupes silanols tendent à être plus prononcées et plus variable de lots à lots. De petites différences de temps de rétention sont moins importantes qu’en HPLC .

   Une phase SPE sera sélectionnée  qui retiendra l’analyte fortement pendant la préparation de l’échantillon.  Des échantillons ionisables suggèrent l’utilisation de phases échangeuses d’ions d’autant plus que l’analyte peut être élué avec une phase aqueuse mobile par un changement de pH ou un accroissement de la force ionique.  La fraction analyte peut être injectée directement dans la colonne HPLC après ajustement du pH pour minimiser l’ionisation de l’analyte et optimaliser sa rétention sur la phase inverse.

Des analytes neutres peuvent être séparés sur des phases inverses ou normale.  Les phases normales sont recommandées pour des analytes plus polaires et les phases RP-SPE pour des analytes moins polaire et plus hydrophobes.

 

Les lignes de conduites   

Avant de commencer le développement d’une méthode SPE, il est important de se demander:

 -De quels renseignements disposons- nous au sujet de l’échantillon?

Quelles sont les propriétés de la matrice et de l’analyte de l’échantillon (polaite, non polaire, solubilité, acide ou base)? Est-ce que l’analyte présente des groupes fonctionnels qui peuvent être exploités afin d’affecter l’étape de clean up de l’échantillon? Sont-ils différents de la matrice.

 -Quelle est la concentration de l’analyte attendue ou la gamme de concentration dans l’échantillon?

 - Quelle est la composition de la matrice? Est ce que la matrice a des groupes fonctionnels qui peuvent être exploités pour effectuer une séparation? Est ce que les propriétés de la matrice suggèrent que des phases SPE doivent être évitées? Quel est le pH de la matrice ? Est -ce que la matrice varie d’échantillon à échantillon?

 - Quel est le but du prétraitement de l’échantillon: l’élimination d’interférences ? un accroissement de la sensibilité? L’élimination de substances néfastes pour la colonne HPLC?

Une réponse à ces questions peut faciliter le développement de la méthode SPE.

   Une vue d’ensemble du développement de la méthode SPE est présentée dans la figure 1.7.  Un guide grossier àn la sélection des conditions préférées est choisi, basé sur les caractéristiques connues de l’analyte (solubilité dans l’eau en fonction solubilité solvant organique, ionique et non ionique)  Cette figure classifie tous les analytes en huit groupe différents et pour chaque groupe des phases SPE et des solvants différents sont suggérés.

Mais d’autres facteurs en dehors des propriétés de l’analyte peuvent être important.

 - Quelles sont les interférences qui peuvent être présentes?

 - Quel est la nature du solvant de l’échantillon ?

 - Y a t’il un choix de solvant pour l’échantillon

 - Quel est le but majeur de la séparation SPE : séparation pour cette échantillon ?

 Une approche plus empirique est pour cette raison plus souvent suivie.  Par exemple basé sur des caractéristiques connues de l’analyte, plusieurs phases SPE sont des choix possibles.

Chacune de ces phases  peuvent être testées pour la rétention des analytes et interférences, permettant un meilleur choix des conditions finales.

L’extraction en phase solide et la séparation HPLC sont similaires si bien que les mêmes considérations affectent le meilleur chois de la phase mobile et de la phase stationnaire.

 Considérations préliminaires

Avant la sélection des conditions pour les étapes de 1 à 5  le packing SPE et le solvant pour l’échantillon doivent être choisis.  La principale exigence pour le packing est que l’analyte soit fortement retenu dans le solvant utilisé pour dissoudre l’échantillon.

Lorsque l’échantillon contient des analytes ionisables telles que des solvants organiques ou des amines, une modification du pH (plutôt qu’une modification du solvant) peut être utilisée pour retenir et déplacer des composés de la cartouche RP-SPE.

   Les packings échangeurs d’ions se présentent sous deux formes: forts et faibles.

Les échangeurs d’ions forts sont normalement préférés si une forte rétention de l’analyte est l’objectif principal.  La rétention avec des échangeurs d’ions faibles est plus dépendant du pH, le choix du pH est un compromis entre le maintien du caractère ionique de la phase stationnaire tout en s’assurant que l’analyte ionique est resté dans son état ionique.  Par exemple une résine carboxylique faible échangeuses de cations pour la séparation d’amines protonées, le pH doit être choisi afin que l’amine soit sous sa forme protonée et que le groupe carboxylique soit chargé négativement.  Ainsi le pH est une variable puissante pour optimaliser la rétention ou pour relarguer des analytes retenus à partir d’une résine échangeuse d’ions.

     Afin de maximaliser la rétention de l’analyte dans l’étape 2, le solvant de l’échantillon doit être un solvant faible pour la combinaison analyte-packing.  Pour un packing phase inverse, l’eau est le solvant préféré pour l’échantillon avec un minimum de solvant organique ajouté.  Si l’analyte est un acide ou une base, le pH doit être ajusté pour minimiser l’ionisation de l’analyte.  Pour les packings en phase normale, l’hexane ou d’autres solvants hydrocarbonés sont les solvants préférés et au moins polaire au mieux.

Pour les résines échangeuses d’ions, le solvant préféré pour l’échantillon est l’eau, de petites quantités de solvant organiques n’étant pas un problème. 

Etape 1 

   Lorsque des cartouches SPE sont utilisées il est important de réaliser des blancs pour éliminer la possibilité de contamination par des substances extractibles provenant de la cartouche, du fritté, et de la phase.  La cartouche doit être rinsée par un solvant organique (par exemple du méthanol, acétonitrile) ou de l’acide nitrique dilué 0; 01 M avant usage.

 

Etape 2  Application de l’échantillon

      Dans certains cas, l’échantillon se présente sous la forme d’une solution et la question qui se pose est la suivante: l’échantillon est-il laissé tel qu’il se présente ou il est remplacé par un autre solvant après évaporation du premier.  Le facteur commodité suggère de garder le solvant original si possible.  Pour un échantillon en solution aqueuse , la RP-SPE est le choix préféré.  Si l’échantillon est dissoud dans un solvant hydrocarboné ou un autre solvant organique non polaire, la SPE en phase normale peut être utilisée.  Les analytes ioniques ou ionisables sont généralement dissoud dans l’eau ou un tampon et soit la RP-SPE ou l’échange d’ion est applicable.

     Le volume d’échantillon qui peut être appliqué sur une cartouche SPE dépend de

 

A) de la grandeur et du type de cartouche (poids du packing)

B) De le rétention de l’analyte dans le solvant dans lequel est dissout l’échantillon.

C) Des concentrations respectives d’analytes et d’interférences dans l’échantillon.

 Il est souvent nécessaire d’appliquer un volume d’échantillon aussi grand que possible afin optimaliser la concntration en analyte dans la fraction SPE  afin d’avoir une sensibilité à la détection optimale dans la séparation HPLC subséquente. Bien que l’utilisation de cartouches plus grandes permette un volume d’échantillon plus grand, ceci peut ne pas affecter la sensibilité à la détection puisque la concentration en analyte maximale dans la fraction SPE ets déterminée par le rapport volume de l’échantillon / poids du packing.

C’est pourquoi la quantité d’échantillon disponible est petite, la plus petite cartouche SPE qui n’est pas saturée par l’échantillon est préférée. 

La capacité de la cartouche plus les interférences est estimé grossièrement à 10 à 20 mg par gramme de packing.

   Une fois que la cartouche a été choisie; le volume maximum d’échantillon peut être déterminé en appliquant un grand volume d’échantillon et en collectant de petites fractions.

Les fractions sont alors injectées en HPLC afin de déterminer le volume d’échantillon maximale avant l’émergeance de l’analyte.  Lorsque cette expérience est réalisée la concentration de l’analyte qui sera choisie sera la valeur maximale attendue dans l’échantillon.  Le volume d’échantillon final choisi sera un peu plus petit que la valeur déterminée de cette façon afin de permettre l’élimination d’impureté dans l’étape 3 sans perte d’analyte.

 

ETAPE 3-4  (Lavage de la cartouche et élimination des interférences)

 L’objet de cette étape est d’éliminer autant que possible les interférences à élution rapide.

Ce but peut être réalisé en choisissant un solvant de lavage W qui assure un temps de rétention intermédiaire de l’analyte ( p.e. 3<k<10) sous les conditions de séparation et en présence de la matrice de l’échantillon.  L’analyste utilisera un volume de lavage aussi grand que possible, afin d’éliminer les impuretés à élution rapide tout en retenant l’analyte sur la cartouche.  Le volume optimum de solvant de lavage peut être déterminé par collection des fractions et dosage de l’analyte.

   Il y a deux approches pour déterminer la meilleure composition du solvant de lavage.

Le développement d’une méthode SPE commence rarement avant qu’il n’y aie un dosage HPLC de l’analyte standard.  Si le même type de packing est utilisé à la fois pour la SPE er HPLC (p.e Reversed phase), les données de rétention  peut fournir une estimation initiale de la composition du solvant de lavage.

Si la composition de la phase mobile HPLC est de 30 % ACN -tampon, l’analyste commencera avec 30 % ACN comme solvant de lavage.  Si l’analyte commence à quitter la colonne avant 5 à 10 volumes de cartouches de solvant de lavage ont été collecté [1 volume de cartouche (µL) = 1 mg de packing], le solvant de lavage est trop polaire.  Diminuer le pourcentage de B et recommencer l’expérience.

    Une seconde approche est d’appliquer l’échantillon, de laver la cartouche avec 5 à 10 volumes de solvant successivement de plus en plus fort (p.e  25%, 50 %, 75 %, 100 % B) et en regardant l’effluent d’extraction  à chaque concentration déterminera le profil d’élution de l’échantillon.

 

ETAPE 5 ( Elution de l’analyte

 1.  L’objet de cette étape est de collecter tout l’analyte dans le plus petit volume d’échantillon possible tout en excluant autant que possible les interférences à élution tardive et les tueurs de colonnes. 

2.  Un autre but est d’obtenir la fraction analyte sous une forme qui peut être directement injectée sur la colonne HPLC.

 Ces buts sont mutuellement contradictoire, l’utilisation d’un solvant d’élution très polaire (si bien que k=0 pour l’analyte) va minimiser le volume d’échantillon mais il est peu probable qu’un grand volume de la fraction analyte puisse être injecté sur la colonne. HPLC.  Un solvant d’élution juste assez fort pour éluer l’analyte (k ~ 2)minimise la contamination de la fraction analyte par des substances à élution tardive mais augmente le volume et rend peu probable l’injection totale de la fraction analyte.  L’utilisation de packing moins polaire SPE (p.e cyano) peut minimiser ce problème.  Lorsque des substances à élution tardive présentent un problème, la meilleure approche est l’élution de l’analyte avec 1<k<5.  Si la sensibilité de la détection est critique si bien que tout l’analyte doit être injecté en HPLC, l’évaporation à sec peut être nécessaire et la redissolution de l’analyte peut être requise.  L’évaporation d’échantillon aqueux ets inconvéniente si bien que la lyophilisation est une alternative.  Si des cartouches SPE en phase normale sont utilisées les composés moins polaires seront moins retenu alors qu’ils sont éluer tardivement en RP-HPLC.

  Si l’analyte est un acide ou une base, la polarité du solvant de lavage et les étapes d’élution en RP-SPE peunent être ajustée par modification du pH. 

Cette approche rend plus facile la sélection des conditions qui permettent l’injection directe de la fraction analyte totale sans contaminer la fraction analyte avec des élueurs tardifs qui augmentent le temps de séparation en HPLC .  Des packings SPE avec résine échangeuse d’ions a plus de chances de fournir une fraction analyte idéale pour une analyse HPLC subséquente.  Bien que des colonnes HPLC à base de silice ne doivent pas être utilisées en dehors d’un domaine de 2<pH<8 e raison de la dissolution du packing et de sa dégradation, les cartouches SPE à usage unique peuvent être utilisées dans un domaine plus large de pH.

Il est peu probable que la présence de petites quantités de silice dissoutes ou ou de phase liées hydrolysée interfèrent avec une analyse HPLC subséquente.  Si de la silice dissoute dans la fraction analyte est un problème, des cartouches SPE polymérique sont stables pour 1< pH<14 et peuvent être un meilleur choix.

 Exemple d’une méthode de développement SPE: Isolement de l’Albuterol du plasma Humain. 

 L’isolement de l’Albutérol sera utilisé pour illuster une méthode de développement SPE typique.  Ce médicament est largement utilisé comme vasodilatateur bronchique dans le traitement de l’asthme. 

La concentration thérapeutique attendue dans le plasma humain est très basse (maximum < 20 ng/ml,après ingestion d’une tablette de 8 mg) .  L’Albutérol (MW 239) est composé polaire hydrophile avec deux groupes ionisables, un phenol (pKa = 9.4) et une amine secondaire (pKa = 10).  En solution aqueuse, ce composé existe principalement sous sa forme ionique à tous les pH.  Pour ces raisons, l’albuterol se partitionne mal dans les solvants organiques à partir de solutions aqueuses et l’isolement par pair d’ions basé sur la LLE fut tentée.  A pH << 10, l’addition d’un réactif d’appariement anionique au système LLE pouvait permettre la formationj de paires d’ions avec l’albutérol et faciliter son extraction dans la phase organique.  Il fut déterminé que l’extraction par pair d’ions avec l’acide diethylhexyl phosphorique donnait lieu à des récupérations élevées de l’analyte dans la phase organique.  Cependant l’extrait était hautement contaminé avec des composés plasmatiques endogènes  et les chromatogrammes HPLC résultant présentaient des interférences de background innacceptables.

  SPE fut essayé.  Il y a plusieurs fonctionnalités polaires et non polaires qui peuvent être exploité pour la rétention SPE.  Chacun des modes ( non polaire, échange de cation, échange d’anions, polaire, affinité) sont supposés retenir le médicament.  Des investigations par essais et erreurs furent entreprises avec ces cinq modes pour trouver un solvant de lavage SPE qui pourraient au mieux éliminer les interférences de la cartouches sans affecter l’analyte.  Une série de 17 phases SPE différentes appartenant à ces cinq modes furent testées en vue de la meilleure récupération avec 23 systèmes de solvants.  De l’Albutérol tritié fut ajouté au plasma humain contrôle afin de se rendre compte des caractéristiques d’élution et de rétention.  L’analyse radiochimique en procédant au radiocomptage des fractions collectées  fut utilisée pour doser les effluents et lavage de colonne pour l’albutérol.  Il fut trouvé que la facilité avec laquelle ce composé pouvait être éluer des diverses phases SPE est très variable et dépend de la phase stationnaire et des solvants d’élution utilisés.  Certains solvants d’élution n’éluaient pas l’albutérol de certaines cartouches SPE et ces solvants furent retenus comme candidat possible en vue d’une utilisation comme solvant de lavage dans l’étape 2.

    Après ces expériences , quatre cartouches SPE furent sélectionnées pour des investigations ultérieures assez que le fait apparaître la table ci-dessous

 

Type de Cartouche SPE

Solvant d’élution

% de récupération

Commentaires sur la méthode

Cyano

10 % 1 M NH4Ac + 90 % MeOH

89

Extrait propre, petit volume, acceptable

Silice

Ibidem que ci-dessus

94

Extrait propre, petit volume, acceptable

Phase phenylboronate

0.1 M   H2SO4

90

Extrait propre, petit volume mais éluent trop acide pour système HPLC

C18

Isopropanol

92

Extrait pas assez propre,

enréchissement de traces pas reproductible,

inacceptable

 

  RESULTATS SPE POUR LA RECUPERATION DE ALBITEROL DU PLASMA

 Ces phases apparurent initialement comme prometteuses, les extraits présentant de faibles taux de matériel plasmatique endogène, une bonne compatibilité avec les systèmes HPLC et des récupérations acceptables de l’albutérol du plasma.

Deux phases SPE (cyano, silice ) se révélèrent acceptable et la méthode finale est présentée dans la figure ci-dessous

                                   

                 Méthode finale d'isolement de l'Albutérol à partir du plasma humain

 

1.4.2.7  Chromatographie sur colonne pour le prétraitement d’échantillons

 Avant l’usage généralisé de la SPE pour le prétraitement d’échantillon, des séparations similaires se faisaient par chromatogarphie liquide (LC) basse pression et en colonne ouverte La LC est encore utilisée comme une technique de prétraitement d’échantillon spécialement pour les pesticides, pour des médicaments ou composés endogènes dans les fluides biologiques et pour le fractionnement de biomolecules sur des gels de polydextran tel le Sephadex (Pharmacia, Upsala, Sweden)

La LC est habituellemnt considérée comme similaire à la SPE avec des cartouches à usage unique; les différences principales sont

 

A)  La colonne LC est considérablement plus grande que la cartouche SPE

B)  La colonne LC est remplie par l’utilisateur

C) Les remplissages inorganiques comme la silice, l’alumine et le Florisil sont utilisés de façon prédominante

 

1.4.3  SEPARATIONS PAR MEMBRANE  

 Les membranes sont généralement constituées de polymères organiques synthétiques ( p.e PTFE, nylon ou le chlorure de polyvinyl), la cellulose ou les fibres de verre.  La filtration et l’extraction en phase solide avec des disques représentent les applications majeures des membranes pour la préparation d’échantillon.  Les analytes peuvent également traverser une membrane par diffusion comme résultat de gradients chimiques ou électrochimiques. 

L’ultrafiltration, l’osmose inverse, la dialyse, la microdialyse et l’électrodialyse sont des exemples de techniques qui utilisent des membranes pour la concentration, la purification et la séparation des analytes.

Les membranes sont produites sous diverses formes :

A) feuilles                                                    

B) rouleau

C) disque

D) capsules

E) cartouches

F) membranes spiralées

G) fibres creuses

 Les membranes semi-perméables permettent le passage sélectif de certains composés seulement.  Les membranes microporeuses semi-perméables permettent la filtration sélective d’après la grandeur des micropores.  Par exemple, les membranes ont des limites de passage pour des molécules de poids moléculaire donné, elles permettent le passage de petites molécules (médicaments), prévenant le passage de molécules plus grandes ( p.e protéines).  Des membranes poreuses électriquement chargées ou des membranes échangeuses d’ions ont des pores présentant des charges positives ou négatives qui y sont fixées.  Le passage de molécules ioniques à travers la membrane est gouverné par la grandeur des pores et la charge de la membrane.

La figure ci-dessus illustre l’utilisation d’une membrane semi-perméable typique dans un système de dialyse dynamique.  La solution de l’échantillon (donor) est placée d’un côté de la membrane et de l’autre côté il y a un liquide accepteur (acceptor).

Dans certains cas, les interférences diffusent à travers la membrane, laissant une solution purifiée du donneur.  Le plus souvent l’analyte passe au travers de la membrane dans la solution acceptrice, laissant les interférences dans la solution on se trouvait l’échantillon.

Un avantage des techniques de séparation membranaire pour la RP-HPLC est que à la fois lez liquides donneurs et accepteurs sont généralement de l’eau ou un tampon. Les séparations membranaires peuvent être réalisées dans des systèmes statiques ou dynamiques (flow) avec le dernier mieux adapté à l’automatisation.

A l’exception des membranes de filtration et SPE, les techniques de séparation membranaire n’ont pas été largement utilisées pour la préparation des échantillons en HPLC.  Cependant pour séparer de grosses macromolécules telles que les protéines de petites molécules (comme des médicaments et métabolites), la dialyse dynamique (flow) en utilisant une membrane sélectionnant des masses moléculaires peut donner des résultats satisfaisants.

Comparée à d’autres techniques de préparation d’échantillons, les séparations membranaires sont plus lentes et efficientes puisqu’elles sont capable de concentrer l’analyte que la SPE ou la LLE.  La migration de petites molécules neutres à travers une membrane semi-perméable est le résultat de la différence en concentration en analyte de chaque côté de la membrane.  Une fois la concentration égalisée, il n’y a plus de migration.

Les points suivants doivent être respectés afin d’utiliser les techniques membranaires avec succès.

 

1.  L’élimination des analytes afin de maintenir une concentration différentielle (l’élimination de l’analyte est le mieux réalisé en utilisant u système statique du côté donneur et dynamique du côté accepteur, avec un moyen de capter ou de concentrer l’analyte en question.

 2. Une modification de l’état chimique de l’analyte (p.e  passage de l’état non chargé à l’état chargé).

 3.  La possibilité d’utiliser des récupération << 100 % (voir exemple ci-après).

 L’une des applications des membranes dans le préparation d’échantillon est l’utilisation de la dialyse dynamique couplée à l’enréchissement de traces.  La dialyse dynamique est un processus de séparation membranaire dans laquelle la solution donneuse contenant l’analyte et la solution acceptrice coulent au travers de canaux qui sont séparés par une membrane demi-perméable qui est le plus souvent une membrane travaillant sur la base d’une sélection de poids moléculaire.  De petites molécules passent librement à travers la membrane, mais des molécules plus grandes que la barrière de poids moléculaire ne peuvent pénétrer.   Pour des systèmes qui ont tendance à former des émulsions ( p.e ectraction d’oeufs ou des produits contenant des graisses tels que le lait, la dialyse dynamique s’est avérée une technique d’isolement efficace qui utilise peu ou pas de solvants organiques.  Des solutions avec une forte concentration en constituents telles que des protéines, des substances humiques, des macromolécules lipidiques ou des paticules colloïdales peuvent être traitées sans détérioration de la membrane pour de longues périodes (semaines).

Des analytes liés à des protéines ou enfermés dans ou sur des organelles ne peuvent pas traverser la surface de la membrane.  C’est pourquoi le dialyse peut être une technique utile pour mesurer les concentartions de drogues libres par rapport à celles qui sont liées. 

Une large variété de matériaux allant des acétates de cellulose fortement hydrophiles aux polymères synthétiques (p.e  polysulfone) sont disponibles pour fournir une sélectivité unique dans le cadre du processus de séparation membranaire.

Les techniques d’enréchissement de membrane supportée par un liquide sont similaires à la microdialyse dynamique excepté que la membrane poreuse en PTFE sépare les deux solutions aqueuses.  La technique est une combinaison de la dialyse and de l’extraction liquide-liquide.  Initialement, la membrane est imprégnée avec un solvant organique (p.e n-undecane) et est placée dans un bloc dans lequel la membrane sépare deux compartiments.  Les composés sont extraits du côté donneur dans la membrane suivant leur solubilité dans le liquide supporté imprégnant la membrane et d’où ils sont réextraient de la membrane dans le compartiment accepteur. 

Un simple exemple de l’utilisation de cette technique est l’enrichissement en un acide carboxylique à partir d’une solution aqueuse donneur.  En ajustant le pH de la soluition donneur en dessous de la valeur de pKa de l’acide, l’ionisation de l’acide carboxylique est supprimée, permettant à la forme non-ionique d’être extraite dans le liquide immobilisé sur la membrane.  L’acide non-ionisé diffuse à travers la membrane du côté accepteur qui présente un pH basique ou l’acide organique est extrait sous sa forme ionisée.  C’est pourquoi l’anion carboxylate est concentré puisqu’il ne peut plus repasser dans la membrane.  Les facteurs d’enrichissement (concentyartion du côté accepteur divisé par la concentration du côté donneur) peuvent atteindre plusieurs centaines.En plaçant une précolonne entre l’appareillage à membrane et l’instrument HPLC, il est possible de concentrer l’analyte encore plus.  Par le biais d’un saut de valve, l’expérimentateur peut reéluer l’analyte concentré dans l’injecteur HPLC.  Quelques applications de membranes supportant un liquide incluent l’analyse des amines aliphatiques et aromatiques dans l’urine, l’évaluation d’herbicides acides dans les eaux naturelles et les chlorophénols dans l’eau.

   

MICRODIALYSIS

 La microdialyse une application spécialisée de la dialyse, utilise de petites microsondes tubulaires de silice fondue avec une membrane à une extrémité.  Ces sondes peuvent être placées dans des systèmes vivants (p.e, le cerveau du rat) et la diffusion de petites molécules organiques à travers la membrane peut être mise en évidence en direct par HPLC sans déranger l’animal ou la plante.  Une pompe à microseringue est utilisée pour pomper l’échantillon dans la boucle de l’injecteur. De petites sondes à microdialyse insérée dans des systèmes vivants permettent des études sur l’analyte qui ne seraient pas possible par d’autres méthodes de prétraitement de l’échantillon.  Dans la plupart des cas, il n’y a pas d’autres clean ultérieur à faire et les dialysats peuvent être injecté directement sur la colonne HPLC.

La microdialysis s’est avérée utile en neurochimie pour les études in vivo des catécholamine du cerveau pour les rats de laboratoire, pour les études de pharmacocinétique de l’acétoaminophen dans le tissu subcutané et pour la mesure inositol triphosphate dans des jus de fermentation.  Un désavantage de la microdialyse est qu’il n’y a pas de méthodes de calibration existante permettant la détermination précise des concentrations in vivo. 

 

ULTRAFILTRATION (UF)

 L’échantillonnage par ultrafiltration est similaire à la microdialyse excepté que la force exercée à l’écoulement à travers la membrane est le résultat de la pression différentielle (10 à 100 psi) à travers la membrane. Comme dans le cas de la dialyse, de petites molécules sont collectées du côté accepteur.  Les sondes UF sont légèrement plus grosses que les sondes à microdialyse si bien qu’elles se prêtent moins bien à une utilisation dans les systèmes vivants.  Les membranes UF sont disponibles avec des barrières de poids moléculaires allant de 300 à 300000.

Des exemples de l’utilisation de l’UF dans la préparation d’échantillon sont la mesure du glucose chez des souris diabétiques et le monitoring in vivo de l’acetaminophen dans des tissus subcutanés.

  Des membranes UF sont également disponibles sous la forme d’appareillage à usage unique pour le traitement d’échantillons biologiques.  La séparation UF est réalisée en versant d’abord l’échantillon dans l’enceinte filtrante et une pression d’air ou de gaz est appliquée au travers de l’embouchure de fermeture.  Les protéines concentrées et d’autres molécules plus grande que la grandeur des pores sont retenues par le filtre, tandis que l’eau, les sels et des composants solubles de faible poids moléculaire sont collectés dans le filtrat de collection.  Des exemples de membranes de séparation UF sont  des membranes cellulosique régénérée avec avec un “cut-off” nominal de 10.000 de poids moléculaire et des membranes polysulfones avec des capacités de binding plus élévées pour les protéines et avec des “cut-off” de 10 K, 30K, 100 K et 300 K (NMWL), les deux types sont disponibles chez Millipore (Bedford Massachustetts).

 Les avantages donnés par l’utilisation des membranes par à d’autres techniques de préparation d’échantillons sont les suivants:

 - Les risques de surcharge par des composants de l’échantillon ou de la matrice sont

   négligeables.

-  La plupart des processus de séparation membranaire sont réalisés dans un système dynamique d’écoulement fermé minimisant la contamination et l’exposition à des substances toxiques.

- L’utilisation de solvants organiques est minimale.

- Le système dynamique d’écoulement permet l’automatisation.

 

 Les membranes présentent les désavantages suivants par rapport à d’autres méthodes de préparation d’échantillons.

-Les pores des membranes peuvent être obstrués par des particules ou des macromolécules; une fois les pores bouchés, le débit et l’efficacité de la membrane diminue.

- Parfois les échantillons doivent être prétraités avant qu’ils ne puissent être dialysé ou nettoyé par d’autres méthodes de préparation d’échantillons.Par exemple des particules doivent être enlevées d’échantillons alimentaires avant dialyse.

L’efficacité de la dialyse, c’est-à-dire le rapport de l’analyte dans le compartiment accepteur par rapport à celui du donneur est de 5 à 10 %. 

 

1.5 Changement de Colonne (column switching)  

 Le changement de colonne ou chromatographie sur colonne multidimensionnelle ou encore chromatographie sur colonne couplée est une technique puissante pour la séparation et le nettoyage d’échantillons complexes.

Dans cette approche une portion du chromatogramme d’une colonne initiale (colonne 1) est transférée sélectivement à une deuxième colonne (colonne 2) pour une séparation ultérieure. (fig. 1.14a).

La chromatographie multidimensionnelle (CS) est utilisée pour

 - L’élimination de “tueur de colonne” avant la colonne 2

-L’élimination d’élueurs tardifs avant la colonne 2

- L’élimination d’interférences qui peuvent recouvrir les bandes de l’analyte dans la

   colonne 2.

- Une alternative au gradient d’élution

- Enrichissement de traces.

 La réalisation de l’un ou de plusieurs de ces buts résulte en une capacité de traitement de l’échantillon améliorée comparée à l’opération à colonne unique.  Le but primordial de la CS est de maximaliser l’injection de la bande de l’analyte sur la colonne 2 tout en minimisant l’injection de composés interférants (le même but qu’en SPE).

En HPLC, la chromatographie multidimensionnelle est réalisée en connectant la colonne 1 à la colonne 2 via une valve à haute pression.  De cette façon, l’échantillon est partiellement séparé sur la colonne 1 et une fraction contenant l’analyte est dirigé sur la colonne 2 pour assurer la séparation finale.  Bien que la CS soit similaire aux analyses HPLC de fractions fournit par la SPE , deux différences majeures existent:

 1.  Les cartouches SPE sont utilisées une fois et éliminées; la colonne 1 en CS est utilisée de façon répétée bien que pour un nombre d’injection moindre (p.e 50 à 100) que la colonne HPLC usuelle.  C’est pourquoi en chromatographie multidimensionnelle des étapes de lavage sont requises pour assurer que les interférences sont éliminées de la colonne 1.  Ces impuretés peuvent affecter la performance de la colonne 1 ou montrer un pic d’élution supplémentaire de la colonne 2 dans des analyses subséquentes.

 2. La colonne 1 présente une meilleure efficacité (dp entre 5 et 10 µm) comparée aux cartouches (dp dans le domaine de 40 µ). Ainsi la largeur de bande de l’analyte de la colonne 1 est plus étroite ce qui permet d’obtenir une meilleure résolution sur la colonne 1 que sur une cartouche SPE et des échantillons plus propres pour une séparation HPLC finale plus facile.

 Le tableau 1.14 résume quelques autres avantages et désavantages de la CS.  Comparer ces caractéristiques avec la séparation off line en utilisant des cartouches SPE ou un autre prétraitement de l’échantillon.

 Caractéristiques de la chromatographie multidimensinnelle

 

Avantages

Désavantages

Facilement automatisable spécialement avec les chromatographes modernes

Nécessite une hydraulique ou pneumatique plus complexe, valves de dérivasion, équipement plus couteux.

Moins de chance de perte d’échantillon puisque l’expérience se fait en système fermé.

Difficile de manipuler des traces de composés puisque fort dilué et dans de grands volumes.

Permet de configurer le système de valve de telle sorte à satisfaire au mieux au besoin (p.e concentration sur une colonne , backflush)

Les solvants pour les modes primaires et secondaires doivent être compatibles.

 

1.5.1  Principe d’ Opération 

 La chromatographie multidimensionnelle ou commutation de colonne (column switching: CS) peut être réalisée soit manuellement ou automatiquement mais ma plupart des applications CS sont complètement automatisées.  Des valves commutantes à volume mort faible sont utilisées mise en action par un timer ou comme événement programmable dans le temps par un microprocesseur faisant partie intégrante de l’équipement chromatographique.  Une nécessité expérimentale importante pour la CS est le tranfert complet de l’analyte de la colonne 1 à la colonne 2.  Ceci demande un contrôle très précis des temps de commutation des valves.  Des valves de commutation sont commercialement disponibles comprenant de 2 à 10 valves de commutation ou même plus.  La CS peut être faite avec une seule pompe mais des pompes multiples sont généralement préférées. 

Le système CS le plus simple de la figure ci-contre utilise une seule pompe avec une valve avec trois à quatre porte placée entre la colonne 1 et la colonne 2. Dans la figure 1.14a la position de la valve permet à la phase mobile de la colonne 1 de court-circuiter la colonne 2 et d’être dévié vers la sortie résidu (waste). La position de la valve peut également être changée pour permettre à la phase mobile de passer de la colonne 1 à la colonne 2.

 Par exemple un échantillon contient un analyte qui présente un temps d’élution de 4.9 min (voir figure).  Cependant des élueurs tardifs sortent après un temps de 60 min ce qui est excessif. Ces élueurs tardifs peuvent être éliminés grâce au système CS.  Le même packing de colonne est utilisé dans la colonne 1 et 2 (p.e 5µm C8) mais la longueur de la colonne 1 est de 3 cm et celle de la colonne 2 est de 15 cm .  En raison de sa longueur plus petite, l’élueur lent quitte la colonne 1 après 12 minutes.  Cependant l’analyte est mal résolu par rapport aux pics adjacents.  Si la colonne est commutée sur déchets avant 0.5 min, connectée à la colonne 2 pour 1 minute et recommutée sur déchets pendant les dix minutes restantes, une fraction de 0.5 à 1.5 min contenant l’analyte est envoyé et maintenu sur la colonne 2 tandis que le reste de l’échantillon est éliminé.  La fraction analyte est séparée ultérieurement sur la colonne 2 en commutant la valve dans la position de communication colonne 1-colonne 2 ce qui produit le chromatogramme illustré dans la figure ci-dessous

L’analyte est résolu jusqu’à la ligne de base pour une quantification précise en un temps de d’environ 9 min.  Le temps total pour l’essai est donc de 11 + 9 min = 20 min 

Le temps d’analyse avec CS peut être encore abrégé si une valve à quatre voie est utilisée avec une seconde pompe HPLC.  De cette façon la séparation de l’échantillon sir la colonne 1 et 2 peut être réalisée simultanément avec un temps d’analyse de 12 min.

 

 

1.5.2  Développement méthode de chromatographie multidimensionnelle

 La CS est simple et facile à utiliser lorsque les mêmes phases mobiles passent à travers chaque colonne.  Sous cette forme et en supposant que les longueurs de colonnes adéquates soient présentes, le seul problème subsistant est de choisir les temps de commutation des valves permettant la diversion de tout l’analyte vers la colonne 2 et en envoyant les interférences à temps d’élution précoce et tardif vers la sortie déchets. Les temps de commutation peuvent être obtenus en connectant la colonne 1 au détecteur. 

Pour le développement de la méthode, il est préférable d’injecter l’analyte standard plutôt que l’échantillon réel afin d’éviter les recouvrements de bandes.   L'analyte sort de la colonne 1 entre 0.9 et 1.1 min.  Un contrôle rigoureux du temps de rétention sur la colonne 1 n’est pas toujours possible en raison de certaines variations apparaissant de par l’usage qu’il est fait de la colonne et de l’influence d’autres composants de l’échantillon sur les temps de rétention.  C’est pourquoi, une fenêtre plus large ( de 0.5 à 1.5 min) est habituellement acceptée pour assurer le transfert complet de l’analyte vers la colonne 2.

D’autres applications utilisent un packing de colonne et/ou des phases mobiles différentes pour la colonne 1 et 2.  Dans ce cas, il est nécessaire que la fraction de l’échantillon envoyée vers la colonne 2 soit dans un solvant compatible avec la phase mobile utilisée dans la colonne 2.  Par exemple, une résine échangeuse d’ions peut être utilisée pour la colonne 1 et une phase inverse (RP) pour la colonne 2, si la phase mobile pour la colonne 1 est un tampon aqueux.  Dans ce cas un échantillon aqueux est envoyé vers la colonne 2 et le solvant de cette échantillon est plus faible que la phase mobile solvant organique/eau de la colonne 2.  De façon semblable un packing RP cyano pour la colonne 1 et une C8 ou C18 pour la colonne 2 parce que la phase mobile pour la colonne cyano est plus faible que pour la colonne C8 ou C18.

L’utilisation de différents packings entre la colonne 1 et 2 permet une modification de la sélectivité entre les deux colonnes qui peut être utilisée pour séparer l’analyte d’un grand nombre d’interférences qu’il est possible de trouver dans des mélanges complexes.

 

1.5.3  Exemple de Chromatographie multidimensionnelle pour le nettoyage d’échantillons

 Certains échantillons contiennent des composants qui peuvent endommager la colonne si l’échantillon non traité est injecté.  Deux exemples plutôt communs sont trouvés en analyse pharmaceutique.

 A) Le dosage de médicaments dans le sang ou le plasma

 B) Le dosage de médicaments dans un échantillon ou la matrice est une crème ou une lotion.

 Les échantillons plasmatiques contiennent des protéines qui peuvent s'accumuler sur la colonne et conduire rapidement à une perte d’efficacité. 

Les formulations de crèmes et de lotion contiennent des huiles ou des cires qui sont très hydrophobes et qui sont retenues très fortement sur la colonne RP.

La figure ci-desous illustre une configuration de chromatographie multidimensionnelle qui a été élaborées pour répondre aux problèmes liés à certains types d’échantillons.

La colonne 1 présente un packing du même type phase liée que la colonne 2 (p.e C18).  La phase de la colonne 1 retient moins bien les composés en raison de la présence de pores plus large, le matériel présente une surface spécifique moins importante.  La valve de commutation est positionnée de telle façon à permettre l’écoulement de la phase mobile de la colonne 1 vers la colonne 2 permettant à l’analyte de passer à travers la colonne 2 tandis que les composants de la crème sont retenus sur la colonne 1.  Lorsque l’analyte a quitté la colonne 1, la position de la valve est modifiée de telle façon que la pompe 1 envoie la phase mobile directement sur la colonne 2 pour une séparation ultérieure de l’analyte.  Entre temps la pompe 2 élimine en sens inverse les composants de la colonne 1 afin d’y enlever les composants de la crème et préparer la colonne 1 pour l’échantillon suivant.

 

 

 

 

 

 

 

 

1.6  La Dérivatisation  

 La dérivatisation fait intervenir une réaction chimique entre l’analyte et un réactif afin de modifier les propriétés chimiques et physiques de l’analyte. La dérivatisation en HPLC rencontre les objectifs suivants:

1.  Améliorer la détection

2.  Modifie le structure moléculaire ou la polarité de l’analyte pour une meilleure

     Chromatographie.

3.  Modifie la matrice pour une meilleure séparation.

4.  Stabilise un analyte sensible

 D’une façon idéale, une réaction de dérivatisation doit être rapide, quantitative et produire un minimum de produits secondaires.  L’excès de réactifs ne doit pas interférer avec l’analyse ou devrait pouvoir être facilement éliminé.

   La dérivatisation est souvent le dernier recours lors du développement d’une méthode.  L’introduction d’une réaction en pré ou post colonne introduit plus de complexité et des possibilités d’erreur ou niveau de l’analyse tout en augmentant le temps d’analyse.

Bien que la dérivatisation présente des désavantages, elle peut être nécessaire pour résoudre un problème spécifique de séparation ou de détection.

 1.6.1  Détectabilité.

 A la différence de la GC ou la dérivatisation est généralement utilisée pour améliorer la volatilité ou modifier la polarité de l’analyte, la dérivatisation en HPLC ( à l’exception de l’analyse chirale) est utilisée de façon prédominante pour augmenter la détectabilité de l’analyte.  La première considération à remplir lorsqu’on veut choisir une méthode de dérivatisation par HPLC est de décider quel type de détection est la meilleure.  De plus un choix doit être fait en ce qui concerne la détection pre ou post colonne.

De nombreuses classes de composés peuvent être dérivatisés incluant des acides, des alcaloïdes, des amines , des antibiotiques, des barbituriques, des composés hydroxylés , des stéroïdes.  Les deus types de dérivatisation les plus communes -l’addition d’un chromophore ou d’un fluorophore - permet la détection d’un analyte qui ne peut pas être détecté sous sa forme normale ou pour augmenter la sensibilité. 

De nombreuses réactions organiques peuvent être utilisées pour la dérivatisation d’un analyte.  Cependant, pour l’usage routinier, la meilleure approche est de choisir le réactif de dérivatisation adéquat en utilisant des kits de dérivatisation pré-préparés avec un mode d’emploi étape par étape.  Plusieurs réactifs et méthodes de dérivatisation sont disponibles à partir de sources commerciales (p.e Regis Technologies, Inc, Morton Grove, Illinois, et Supelco, Bellefonte, Pennsylvania).

 

TABLE 1.15   Groupe Fonctionnel et Réactifs de Dérivatisation

Groupe Fonctionnel

Chromomarquage

Fluoromarquage

Acides carboxylique, acide gras, acides phosphorique

PNBDI

DNBDI

PBPB

BrMaC

BrMmC

Alcools

DNBC

Dabsyl-Cl

NIC-1

Dansyl hydrazine

Amines

Primaires

Primaires et secondaires

 

DNBC

SNPA

SDNPA

Dabsyl-Cl

NIC-1

Fluorescamine

OPA

NBD-Cl

NBD-F

Dansyl-Cl

Acides aminés (petides)

SBOA

SDOBA

Dabsyl-Cl

Fluorescamine

OPA

NBD-Cl

NBD-F

Dansyl-Cl

Isocyantes

PNBPA

DNBPA

 

Phénols

DNBC

Dabsyl-Cl

NIC-1

NBD-Cl

NBD-F

Dansyl-Cl

Thiols

Dabsyl-Cl

NBD-Cl

NBD-F

OPA

Abbréviations: voir ci-dessous_

 

 

 

Abbréviations chromomarquage:

Dabsyl-Cl : 4-dimethylaminoazobenzene-4-sulfinyl

DNBA: 3,5-dinitrobenzyloxyamine hydrochloride

NIC-1: 1-naphtylisocyanate

PBPB: p-bromophenacylbromide

PNBA: p-nitrobenzyloxyamine hydrochloride

PNBDI:  p-nitrobenzylN,N’-diisopropylisourée

DNBDI: 3,5-dinitrobenzyl-N,N’-diisopropylisourea

PNBPA: p-nitrobenzyl-N-n-propylamine hydrochloride

DNBPA: 3,5-dinitrobenzyl-N-npropylamine hydrochloride

SNPA: N-succinimidyl-p-nitrophenylacetate

SDNPA: N-succinimidyl-3,5-dinitrophenylacetate

DNBC : 3,5-dinitrobenzyl chloride

Abbréviation fluoromarquage

NBD-Cl : 7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxo-1,3-diazole

NBD-F: 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3 diazole

Fluorescamine:  4-phenylsprio(furan-2(3H),1’-phthalan-3,3-dione

OPA:  o-phthaldehyde

Dansyl-Cl:  5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl chloride

BrMmC: 4-bromomethyl-7-methoxycoumarin

BrMaC:  4-bromomethyl-7-acetoxycoumarin.

 

 

 

1.6.1.1  Détection UV

 Typiquement, un réactif utilisé pour la détection visible UV aura deux groupes fonctionnels importants. Un groupe fonctionnel contrôle la réaction du réactif avec l’analyte et le second est utilisé pour la détection UV.  Le chromophore devrait avoir une large absorptivité molaire avec une bande d’absorption qui peut être utilisée pour maximiser la détection et minimiser le bruit de fond ou background.  La table ci-dessus liste les réactifs de dérivatisation UV disponibles dans le commerce pour la détection UV.   La table ci-dessous donne la liste des chromophores communs utilisée pour la détection UV parallèlement avec la longueur d’absorption et le coefficient d’absorption molaire à 254 nm.  Les réactifs qui ont un coefficient d’absorption molaire de 10000 ou plus permettent la détection dans le domaine de l’échelle inférieure des nanogrammes. 

        Chromophore Longueur d'onde d'absorption maximum Coefficient d'absorption molaire à 254 nm
Benzyl 254 200
4-Nitrobenzyl 265 620
3,5-Dinitrobenzyl - > 10.000
Benzoate 230 faible
4-Chlorobenzoate 236 6300
4-Nitrobenzoate 254 > 10.000
2,4-Dinitrophenyl - > 10.000
Toluoyl 236 5400
Anisyl 262 16000
Phenacyl 250 10.000
4-Bromophenacyl 260 18.000
2-Naphtacyl 248 12.000

 

1.6.1.2  Détection par fluorescence

  Les réactifs de dérivatisation fluorescent nécessite un fluorophore qui possède des bandes d’absorption intense et un bon rendement quantique.  Dû aux propriétés spéciales requises pour une réponse de fluorescence forte, il y a moins de réactifs de dérivatisation fluorescent qu’il n’y en a pour l’UV.  Un exemple de sélectivité pour la détection en fluorescence est la dérivatisation des catécholamines dans des échantillons biologiques.

Les réactifs qui sont communément utilisés pour la dérivatisation des amino acides n’ont pas une sélectivité réactionnelle suffisante pour les catecholamines. Cependant, des réactions ont été développées avec le trihydroxyindole (THI), ethylenediamine (ED) et le 1,2-diphenylethylenediamine (DPE) qui sont hautement sélectifs pour les catécholamines.

Pour l’usage pratique le DPE est le meilleur choix et est le plus sensible pour toutes les catécholamines.  Cette méthode a été utilisée pour mesurer des amines dans le plasma humain.  La séparation peut être réalisée sur une colonne RP et nécessite un simple clean up avec une cartouche SPE remplie avec une résine échangeuse de cation.

 

1.6.2  Dérivatisation pré et post colonne

1.6.2.1  Dérivatisation précolonne.

             Il y a plusieurs avantages à la dérivatisation pré-colonne par rapport à la dérivatisation post-colonne.  Dans la dérivatisation pré-colonne, l’analyste peut réaliser la dérivatisation et tranférer l’échantillon dans un récipient approprié pour l’analyse.  Les dérivatisation pré-colonne et post-colonne peuvent être réalisées manuellement ou automatiquement.  Plusieurs constructeurs d’instrumentation analytique ou de robotiques offrent la dérivatisation précolonne automatisée.  Il n’y a pas de restriction concernant la cinétique de la réaction de dérivatisation pour peu que tous les réactifs, analytes et espèces dérivatisées soient stables. Les procédés de préparation d’échantillons peuvent être utilisés pour éliminer

A)  Les produits secondaires

B) les interférences de l’échantillon

C) modifier le solvant de l’échantilon pour le rendre compatible avec la phase mobile.

Certains inconvénients de la dérivatisation précolonne sont l’introduction de contaminants, perte d’analyte par adsorption, des réactions secondaires indésirées, le dégradation de l’échantillon, le transfert de l’échantillon, une réaction qui peut être incomplète. Un temps additional est nécessaire pour la dérivatisation et la complexité additionnelle peut résulter en une précision moins bonne de la méthode.

1.6.2.2  Dérivatisation post-colonne

            La dérivatisation post-colonne est généralement accomplie en utilisant un détecteur réactionnel ou l’analyte est dérivatisé après la séparation mais avant la détection. Le design des détecteurs réactionnels tient compte de la dispersion de l’échantillon dans le système réactionnel.  Les trois approches principales au design de ces réacteurs sont l’approche capillaire, les lits compactés et la segmentation par air pour tenir compte des vitesses de réaction rapide (< 1 min), lente (1 à 5 min) et encore plus lente (de 5 à 20 min), respectivement. 

Les avantages principaux de la dérivatisation post-colonne sont:

1. Un minimum de formation d’artéfact.

2. Une réaction complète n’est pas nécessaire si elle est reproductible.

3.  La chromatographie de l’analyte n’est pas affectée.

 

Les désavantages de la dérivatisation post-colonne sont

1. Un élargissement de bandes pour toutes les réactions exceptées les plus rapides.

2. Des temps de réaction trop longs

3. Des imcompatibilités possibles entre la phase mobile et les réactifs de dérivatisation.

    La meilleure phase mobile peut être incompatible avec les conditions de dérivatisation

    optimalisées.

 

1.6.3  L’analyse Chirale par dérivatisation.

 A la différence des dérivatisation pour des séparations achirales, l’utilité majeure des dérivatisations chirales est d’améliorer la séparation et pas la détection.  La méthode la plus ancienne de séparation chirale est la dérivatisation et plusieurs groupes fonctionnels peuvent être dérivatisés.  La dérivatisation chirale a été appliquée à la fois à la chromatographie liquide en phase normale et inverse.  Le principe est de faire réagir une molécule cible optiquement active avec un réactif optiquement actif.  En plus de la dérivatisation de dérivés chiraux, l’utilisation de réactifs achiraux peut augmenter la sélectivité de la phase stationnaire chirale (CSP) vis-à-vis de l’analyte chiral. Certains composés n’ont pas de sites de liaison distincts pour obtenir une résolution adéquate en CSP et la dérivatisation avec des réactifs achiraux permet leur résolution.

La séparation de composés chiraux sans dérivatisation ne sera pas traitée.

 

3.2  LA COLONNE 

3.2.1  Introduction

       La colonne est le coeur du processus de séparation HPLC.  La disponibilité d’une colonne haute performance stable est essentielle dans le développement d’une méthode reproductible. Les colonnes commerciales peuvent différées largement parmi les fournisseurs  et même entre des colonnes supposées identiques provenant d’une source unique.  De telles différences peuvent avoir un impact sérieux sur le développement d’une méthode HPLC désirée.  Spécifiquement, différentes colonnes peuvent varier en nombre de plateaux théoriques, en symétrie des bandes en temps de rétention , dans l’espacement des bandes et en temps de vie.

Nous nous proposons de donner quelques informations relatives aux supports de colonne, les phases stationnaires et les packings pour colonne.

 

3.2.2  Caractéristiques des colonnes et packings de colonnes

3.2.2.1  Les particules pour le remplissage des colonnes

         La plupart des colonnes utilisées pour les séparations HPLC font usage de particules de silice qui sont appellées le support.  Des colonnes basées sur des supports de polymères poreux ou d’autres matériaux sont également commercialement disponibles pour utilisation dans certaines séparations.  Ces packings non-siliceux sont discutés plus tard en termes de leur désirabilité pour des applications particulières.

Cependant en raison de leur large utilisation , nous allons décrire les particules avec un support de silice avec une couche organique de surface liée au support de silice telle les C18 ou C8.

     Plusieurs types de particules sont disponibles pour les applications HPLC et sont illustrées dans la figure ci-desous:

Microspheres totalement poreuses

Elles sont le souvent utilisées en raison d’un compromis favorable de propriétés désirées: efficacité, quantité d’échantillon injecté, durabilité, et disponibilité.  Ces particules sont disponibles en une variété de diamètres, grandeurs de pores et surface spécifiques si bien que tous les types de méthodes HPLC peuvent être développées avec ces matériaux.

Particules microparticulaires

Elles ont une partie centrale solide avec une pellicule extérieure mince de phase stationnaire interactive.  Ces particules siliceuses ou polymériques généralement disponibles avec des grandeurs particulaires de 1.5 à 2.5 µm ont une efficacité remarquable pour les macromolécules en raison de la cinétique rapide de transfert de masse.  Ces microparticules solides ont une capacité de charge d’échantillon limitée en raison de la faible surface spécifique et sont donc le mieux appropriées pour l’analyse seulement.  Les colonnes de ces ultra-microparticules génèrent des pics très étroits.  C’est pourquoi un équipement HPLC avec un élargissement extra colonne minimale est nécessaire pour assurer que de petits pics ne sont pas élargis inutilement.

Particules en perfusion

Elles contiennent de grands pores (p.e de 4000 à 8000 A ) pénétrant le support et également inclut un réseau de pores plus petits qui sont interconnectés (300 à 1000 A ) entre les grands pores. A des débits élevés, les solutés peuvent entrés et quitter cette structure de pores par la combinaison de mouvement de convection et de diffusion.

Cet effet minimise l’élargissement des bandes si bien que les grandes particules poreuses ressemblent aux petites particules en terme d’efficacité de colonne.  Les expériences acquises avec ce type de colonne est asez limitée, cependant il semble qu’elle soit le mieux appropriée pour l’isolement à l’échelle préparative de macromolécules telles que les protéines et non pour les petites molécules.

La grandeur particulaire est très importante en HPLC.  Les diamètres de particules d’environ 5 µm représentent un bon compromis en terme d’efficacité de colonne, de contre-pression et de temps de vie.  Des particules de pores plus petits (p.e 3 µm) sont disponibles pour des séparations plus rapides.  Des particules pelliculaires aussi petites que 1.5 µ sont utiles pour des séparations extrêmement rapides de macromolécules telles des protéines.  Des distributions particulaires étroites (< à 50% de la moyenne) ans tous les matériaux assurent des lits compactés stables, à haute efficacité et avec un minimum de chute de pression.  En fin d’analyse, des colonnes de microspheres totalement poreuses de 3 ou 5 µm répondent à la plupart des séparations HPLC et ces dernières sont donc recommandées.

La table ci-dessous résume les caractéristiques physiques désirées des particules pour l’analyse HPLC.  Pour séparer de petites molécules des particules totalement poreuses avec des pores de 7-à 12 nm (70 à 120 A ) sont utilisées.  Des particules poreuses avec une surface spécifique de 150 à 400 m2/gr sont avantageuses pour séparer de petites molécules.

                             Caractéristiques                                   Usage
particules totalement poreuses de 5 µ La plupart des séparations
particules totalement poreuses de 3 µ Séparations rapides
particules pelliculaires de 1,5 µ Séparations très rapides (macromolécules)
 distribution particulaire plus ou moins 50 % autour de la moyenne colonnes les plus efficientes (stabilité, reproductibikité)
pores de 7 à 12 nm, 150 à 400 m2/g ( pores étroits) Séparations de petites molécules
pores de 15 à 100 nm, 10 à 150 m2/g (pore large) Séparations macromoléculaires

La table ci-dessous donne la liste des propriétés physiques pour les colonnes C18 commercialement disponibles à pores étroits.

          Colonnes Diamètre des pores (nm) Surface spécifique % de volume de porosité (mL/mL)
Hypersil ODS 12            170 57
LiChrosorb C18 10 355 71
Novapak C18 6 - -
Nucleosil C18 10 350 69
Symmetry C18 10 335 66
Zorbax ODS 6 300 55
Zorbax Rx, SB, XDB 8 180 50

Des molécules avec des poids moléculaires plus grand que 10000 Da nécessitent des particules avec des pores plus grand que 15 nm afin de permettre une interaction aisée de ces grosses molécules de solutés avec la structure interne des pores.  Dans tous les cas, le but est diffusion rapide des solutés dans les pores et une bonne efficacité de colonne.

Les surfaces spécifiques de particules à large pores vont de 10 à 150 m2/g dépendant de la grandeur des pores, au plus grand les pores au plus petite la surface spécifique.

 

3.2.2.1.1  Les particules de Silice

Les matériaux siliceux sont actuellement les packings les plus populaires en HPLC. Ceci est basé sur les caractéristiques favorables des supports de silice qui peuvent être préparé avec une large gamme de distribution de pores (p.e 8,30,100 nm)et avec des grandeurs particulaires de par ex. 10,5,3 µm. Donc, des packings appropriés sont disponibles pour de petites et de grandes molécules et pour des applications analytiques et préparatives.

Un grand avantage des colonnes de silice est leur grande résistance mécanique ce qui permet la formation de lits efficacement compacté qui sont stables sous de hautes pressions pendant longtemps.  Bien que la silice chromatographique soit disponible sous la forme de particules sphériques et irrégulières, les colonnes de particules sphériques ont des avantages inhérents.  Les particules sphériques sont plus facilement compactées de façon reproductibles en des colonnes efficientes. Des colonnes de particules irrégulières peuvent au départ présenter une efficacité comparable à celle des colonnes sphériques de même grandeur particulaire mais les particules irrégulières développent souvent des contre pression qui sont souvent le résultat de la formation de fines  particules formées de par la fracture de particules de formes diversifiées.  De grandes particules irrégulières sont souvent utilisées à l’échelle préparative en raison des couts plus bas.

     Une propriété désirable des supports de silice est que la surface peut être chimiquement modifiée avec une large variété de phases liées qui ont différentes fonctionnalités.

Des packings à base de silice sont compatibles avec de l’eau et tous les solvants organiques sans que des variations dimensionnelles (gonflement) ne surviennent avec le packing de silice lors de changement de solvants.  Ceci permet la réalisation de gradients d’élution.

Cependant, la silice n’est as un support parfait pour les colonnes HPLC en raison d’une caractéristique défavorable de la silice qui est sa solubilité à haut pH.  Pour un temps de vie favorable, certaines colonnes à base de silice (les sil-gel ou du type xerogel formés par précipitation de silicates solubles) ne devraient pas être utilisées au dessus de pH 8.

Cependant des colonnes basées sur des particules formées par aggrégations de sols de silice (appellé type sol-gel) permettent d’opérer jusqu’à des pH de 9.  A des pH > 9 le support de silice peut se solubiliser rapidement dans les phases mobiles pouvant provoquer un tassement du packing avec une diminution de l’efficience et une augmentation de l’asymétrie des pics.

Une autre caractéristique indésirable de certaines silices est l’acidité de surface qui cause des problèmes en vue de la séparation de composés basiques.  Heureusement, de nouveaux supports de silice hautement purifiés sont moins acides minimisant les problèmes potentiels avec des solutés basiques.

Les silices poreuses sphériques pour HPLC sont spécialement synthétisées par différentes méthodes et la figure ci-dessous

compare l’apparence visuelle ( topographie de surface, forme et distribution granulométrique) de diverses particules de silice commercialement disponibles.  Ces matériaux peuvent montrer des propriétés chromatographiques différentes en raison de la variation de l’aire de la surface, de la pureté, de la distribution de la grandeur des pores et de la chimie de surface.

Des silices hydratées contiennent à leur surface des groupes SiOH (groupes silanols).

Une silice chauffée au-dessus de 800 °C perd la plupart de ces groupes silanols et un tel matériau est sans intérêt pour l’HPLC.  Pour un usage optimum, les silices pour HPLC doivent être complètement hydroxylées, c’est-à-dire hydratées avec une concentration maximale de groupes silanol à raison de 8 µmol/m2.

La surface de la silice hydratée peut contenir différents types de groupes silanols comme illustré dans la figure ci-contre.

Les silanols individuels existent sous la forme de trois types généraux identifiés et mesurés par le MAS ou magic-angle-spinning en NMR du silicium 29. 

Les silanols dits libres ou isolés (pas de liaison d’hydrogène) se présentent en concentrations faibles.  Ces groupes silanols libres peuvent cependant provoqués des liaisons non désirées avec les solutés basiques en raison de leur nature très acide. Des silices avec une haute concentration en groupe silanols libres  acides présentent des temps de rétention accrus, des pics large et présentant un tailing pour des composés basiques.

   Des packings de silice complètement hydroxylés  avec la plus haute concentration en silanols géminaux et associés sont plus indiqués pour la chromatographie des composés basiques.  La surface de ces silices contient souvent 25 à 30 % de groupes géminaux silanols qui sont moins acides et plus adaptés à la séparation de solutés basiques.  Ceci est également vrai pour les silanols associés. 

La pureté du support de silice est important pour la séparation de plusieurs composés polaires. Comme illustré ci-dessous

certaines silices sont contaminées  avec certains métaux  (Fe, Al,Ni, Zn, etc).  Ces contaminants métalliques peuvent se complexer avec des solutés chélatant provoquant une asymétrie des pics ou une rétention complète des pics si bien l’élution du pic ne se fait pas.  D’autres métaux inclus dans le réseaux de silice (spécialement l’aluminium) activent les groupes silanols de surface si bien qu’ils sont hautement acide.  C’est pourquoi de la silice hautement purifiée est nécessaire pour de nombreuses séparations HPLC spécialement pour des composés basiques et hautement polaires.  Certaines silices ont des puretés extrêmement élevées comme illustré dans la table ci-dessous pour un type de silice.

                           Eléments                                    Teneurs (ppm)
Na 10
Ca 2
K <3
Al 1,5
Fe 3
Mg 4
Zn 1

Certaines silices chromatographiques ont été évaluées quant à leur possibilité à servir comme support de colonne pour séparer des composés basiques et acides.

Les silices anciennes moins pures et plus acides (appellées type A) peuvent être utiles pour séparer des composés neutres et non-ionisables.  Les nouvelles silices hautement purifiées (appellées type B) donnent généralement de meilleures séparations et sont recommandées pour séparer les composés ioniques et ionisables et spécialement les composés basiques.

La table ci-dessous donne la liste alphabétique partielle des nouvelles silices qui sont utiles pour séparer des composés basiques. Cette liste continue à s’accroître rapidement étant donné que les utilisateurs et producteurs reconnaissent l’avantage de ces colonnes faites de silice chromatographique hautement purifiée.

                  Supports de Silice Colonnes pour séparation de composés basiques
Altima RSIL
Betasil Supelcosil ABZ+
DeltaBond Supersphere RP
Encapharm RP Symmetry
Hypersil-BDS Synchropak RP-SCD
Inertsil Techsphere-BDS
Kromasil Vydac
LiChrospher Select B YMC-Basic
Nucleosil AB Zorbax Rx, SB, XDB

    La figure ci-dessous comparent des séparations pour certains médicaments basiques avec des colonnes C18 basées avec les types A et B de silice. 

La colonne avec le support de silice le moins acide (type B) produit des pics avec une forme de pic et une efficience de colonne supérieure.  De grandes différences dans les temps rétention, espacement des bandes, et tailing peuvent se remarquer pour des séparations effectuées avec des supports de silice différents.  En raison des avantages inhérents aux types de silice A et B il est probable que les méthodes HPLC dans l’avenir seront uniquement développées avec ce type de matériel.

 

 

 

 

3.2.2.1.2  Polymères Poreux

             Les colonnes compactées avec des particules de polymères poreux peuvent également être utiles pour développer des méthodes HPLC.  Certaines de ces particules de polymères (p.e le polystyrene) sont hydrophobes ce qui signifie qu’elles peuvent directement être utilisées pour des séparations en phase inverse sans addition d’un coating de surface.  La plupart des particules polymériques pour HPLC en phase inverse sont faites de polystyrene copolymérisé par du divinylbenzene similaires à celles utilisées pour les résines échangeuses d’ions.  Les particules avec d’autres polymères tels les méthacrylates substitués et les alcools polyvinyliques sont commercialisées mais d’un usage moins fréquent. 

A la fois des particules totalement poreuses et pelliculaires sont disponibles.  Comme pour les supports de silice, les particules de polymères poreux sont réalisées avec des pores étroits pour les solutés de poids moléculaire faible et avec de large pores pour les macromolécules. L’avantage majeur des polymères poreux est qu’ils sont applicables dans une gamme de pH de 1 à 13.  Ces colonnes peuvent être utilisées pour séparer des solutés hautement basique à haut pH ou les composés existent sous leur forme libre ou non ionisée.  L’utilisation de polymères poreux à haut pH souvent produisent de bonnes formes de pics avec des composés hautement basiques dans un état non ionisé.   Cette approche représente une alternative à la chromatographie par pair d’ions pour de telles composés et présente l’avantage qu’il n’y pas d’agents donnant naissance à des  paires d’ions qui sont maintenus dans la phase mobile.

Les polymères poreux à large pores sont également utiles pour séparer des protéines.

En raison de leur stabilité à haut pH, les polymères poreux permettent un nettoyage de materiaux retenus fortement sur la colonne par du NaOH 0.1 N.

Les limitations de ces colonnes polymériques sont une moindre efficience par rapport aux colonnes basées sur de la silice de même grandeur particulaire et certaines applications montrent que le nombre de plateaux théoriques peut être deux fois moindre.  Un problème spécial à signaler avec les colonnes polymériques est qu’elles peuvent gonfler différemment en présence de divers solvants organiques ce qui est préjudiciable pour les séparation avec gradient d’élution puisque des tassements du lit de particules peuvent se produire.  En conséquence il est souvent conseillé de dédier ce type de chromatographie à la séparation isocratique avec un seul solvant organique.

La fonctionnalité de la phase stationnaire peut être modifiées pour des colonnes à base de silice de telle façon à varier la sélectivité des séparations en phase inverse. Des particules polymériques poreuses modifiées avec d’autres groupes fonctionnels tels que C18, NH2,et CN peut également apporter des modifications dans la sélectivité de la phase stationnaire.

Des packings de colonnes polymériques modifiées peuvent avoir des applications comme résines échangeuses d’ions.  Des polymères poreux (p.e le polystyrene copolymérisé avec du divinylbenzène ) avec des groupes fonctionnels ionisables tels COOH, SO3H, NH2, et NR3+, fournissent la base pour séparer une larges gammes de composés acides et basiques.

 

3.2.2.1.3  Autres supports inorganiques

Des colonnes avec d’autres supports inorganiques sont également commercialement disponibles pour le développement de méthodes HPLC.  Ces colonnes sont généralement utiles pour le développement d’application spécifiques.  Du carbone non dérivatisé graphité est de plus en plus accepté comme packing de colonne pour la chromatographie en phase inverse.  Ce matériel est préparé synthétiquement sous la forme de sphères poreuses avec diverses grandeurs particulaires.  La surface du carbone graphité est la base de la rétention et d’autres phases stationnaires ne sont nécessaires. Ce packing de colonne présente ds caractéristiques de rétention plus importante que les phases de silices liée par des groupes alkyl ou les polymères poreux.  Le carbone graphité peut être utile pour séparer certains isomères géométriques.   Des colonnes de carbone graphité sont aussi utiles pour retenir et séparés des composés qui sont hautement hydrophiles et qui ne sont pas retenus adéquatement sur une colonne liée du type C18.  Un avantage spécifique de ces colonnes est qu’elles peuvent être utilisées dans une gamme large de pH et de température. Elles présentent une efficacité moindre que les colonnes de silice et elles nécessitent des phases mobiles de haute pureté puisque des impuretés peuvent s’accumuler sur le lit de la colonne et être éluées de façon soudaine ou être adsorbées de façon irréversible altérant ainsi les performances de la colonne.

    Des packings à base d’alumine existe sous la forme de particules à base de pores étroits et larges de même que des packing à base de zirconium et qui ne seront pas décrits ici

 

3.2.2.2  Configuration de colonnes

La plupart des colonnes en HPLC utilisent des tubes linéaires d’acier inoxydable avec des parois intérieures hautement polies.  L’acier inoxydable est utile pour tous les solvants organiques et la plupart des tampons aqueux.  Cependant, des phases mobiles contenant des chlorures peuvent provoquer des phenomènes d’apparition de fissure de l’acier inoxydable particulièrement à des pH bas.  Néanmoins, elles sont recommandées pour la plupart des applications HPLC. 

          Des colonnes commerciales réalisées en verre , en acier inoxydable gainé de verre et en matière plastique sont également disponibles pour des applications particulières ou l’échantillon peut présenter des interactions défavorables avec l’acier inoxydable bien que peu de problèmes de ce type soient répertoriés avec l’acier inoxydable. La surface de la paroi interne de la colonne est petite si bien que la probabilité pour avoir des interactions non désirées est tout à fait négligeable.  Des échantillons qui se complexes fortement avec les composants de l’acier inoxydable (fer, chrome et nickel) ont le plus de chance de causer des problèmes.

   Des frittés poreux ferment les extrémités de la colonne et retiennent les particules de packing.  Des frittés en acier inoxydable de porosité de 2 et 0.5 µm sont utilisés pour les particules de 5 et de 3 µm , respectivement.  Des problèmes survenant avec les colonnes en acier inoxydable se retrouve au niveau des frittés constitués de la même matière et qui présentent une surface plus importante que les parois de la colonne pour des interactions inadéquate de l’échantillon.  Des formes de pics inadéquates sont des indications que des problèmes de frittés sont possible.  Ces problèmes peuvent être résolus pour ces cas non fréquent par l’utilisation de fritté en titane poreux ou en matière polymérique.

    Des colonnes en verre sont recommandées par certains pour des échantillons d’origine biologique mais limitée dans leur leur usage ( pression limitée < 1000 psi). Des colonnes conventionnelles gainées de verre permettent des pressions conventionnelles mais fragile au point de vue de leur manipulation  et l’expérience a montré que ces colonnes étaient rarement nécessaire pour les échantillons biologiques et que les colonnes en acier inoxydable suffisaient pour la plupart des applications.

   Des colonnes en polymères rigides (PEEK) avec des connexions en la même matière sont disponibles pour des applications ou d’autres matériaux ne sont pas appropriés. Ces colonnes présentent un gainage extérieur en aluminium pour fournir une résistance additionnelle aux fortes pressions.

  Des colonnes avec des embouts à compression sont disponibles avec une large sélection de packing.  Ces colonnes présentent le plus haut degré de performance et de reproductibilité.  Des colonnes cartouches sont essentiellement des tubes sans embouts de fermeture (fitting) et remplie avec la matière de remplissage.  Des embouts de fermeture réutilisable ou connecteurs terminaux connectent ces colonnes à l’HPLC.  Ces colonnes cartouches sont généralement moins chères mais plus attractives pour des mesures de routines lorsque la plus haute performance n’est pas nécessaire.  Le constructeur ne mesure plus la performance des colonnes individuelles mais des performances de lots.

  La table ci-dessous résume les configurations qui sont commercialement disponibles pour les packings de colonne.(acier inoxydable).

              Type  Diamètre intérieur    Longueur (cm) Grandeur de particules (µm)
Connecteurs de compression analytique 0,3-0,46 3-25 3-10
Cartouche 0,3-0,46 7,5 et 10 3-10
Microbore 0,1 - 0,21 15,25 3-8
Semi préparatif 0,8-1,0 10-25 5-20
Préparatif 2,0-5,0 10-25 5-20

Les méthodes analytiques habituellement sont le mieux développées avec des colonnes de  0.46 ou 0.3 cm de diamètre intérieur avec des grandeurs particulaires de 3 à 10 µm.

Des colonnes avec des particules de 5 µm donne en général le meilleur compromis d’efficacité , reproductibilité et de fiabilité.  Des colonnes avec des particules de 3 µm permettent une séparation plus rapide mais elles ont tendance à se boucher plus rapidement ce qui réduit leur temps de vie. Des colonnes avec des fittings de compression sont préférées dans la plupart des applications et elles supportent des pressions plus fortes.

   Des colonnes compactées avec des particules de 3.5 µm apparaissent comme étant un bon compromis entre haute performance et durée de vie de la colonne.  Cette grandeur particulaire améliore substantiellement les performances par rapport aux colonnes avec des particules de 5 µm et pour une même longueur de colonne une résolution équivalente est disponible pour un temps de séparation diminué de moitié.  Egalement des débits plus élevés peuvent être utilisés sans perte appréciable d’efficience si bien que des séparations plus rapides peuvent être réalisées .  Puisque des frittés de porosité de 2 µm sont utilisés pour les colonnes avec des particules de 3.5 µm, elles ont moins tendance à se boucher que les colonnes traditionnelles avec des particules de 3 µm qui utilisent des frittés de porosité 0.5 µm. Des colonnes avec des particules de 3.5 µm nécessitent une distribution particulaire étroite sans fines particules ce qui résulte en des colonnes avec une contre pression raisonnable.

   Les colonnes de 0.3 cm de diamètre intérieur réduisent la consommation de solvant de moitié par à celles de 0.46 cm .  Une diminution de quatre fois est observée pour les colonnes de 0.21 cm (narrow bore) comparée aux colonnes de 0.46 cm .  Les colonnes microbores de diamètre intérieur égale ou inférieure à 0.1 cm utilise même moins de solvant pour les séparations et elles sont disponibles en longueur jusqu’à 25 cm avec des grandeurs particulaires de 3 à 8 µm.  Un avantage majeur des colonnes microbores est une sensibilité de détection plus élevée à la masse de l’échantillon  et ces configurations sont le plus adaptées à des applications ou l’échantillon est limité en masse (pas en volume). Des colonnes de petits diamètres sont souvent utiles pour interfacer des instruments HPLC avec des spectromètres de masse . 

En raison des limitations pour obtenir des lits compactés homogènes avec des colonnes de diamètres étroits, le nombre de plateaux théoriques est souvent moindre que les colonnes comparables de diamètre intérieur de 0.46 cm

  Comme indiqué dans la table 2.5, les colonnes semi et préparatives en acier inoxydable ont munies de colonnes avec des embouts de compression et sont disponibles dans des largeurs de diamètres de 0.8 à 5 cm .

Il y a également des colonnes capillaires remplies de silice fondue avec des diamètres intérieurs jusqu’à  50 µ, elles sont également utilisées pour interfacer des spectromètres de masse.  Une colonne de dimension typique pour cette application est par exemple 25 ou 50 cm x 380 µm ID.  Des particules de 3 ou de 5 µm sont généralement utilisées mais de plus petites particules ont été rapportées.  Un équipement spécial est nécessaire pour utiliser ces colonnes en raison de volumes de pics très petits et la possibilité d’élargissement de pics en dehors de la colonne.

 

3.2.2.3  Les Phases Stationnaires  

3.2.2.3.1.  Les silanes liés

   Les packings RP à base de silice sont réalisés en liant par covalence un organosilane ou en déposant une couche polymérique organique sur la surface d’un support.

Les packings les plus utilisés avec des organosilanes liés par covalence ainsi que illustré dans la figure ci-dessous

De nombreux packings de phases liées sont réalisés avec des réactifs monofonctionnels et certains packings commerciaux utilisent une couche de surface polymérisée résultant de la réaction de silanes trifonctionnels avec la surface de la silice.

 

 

 

 

 

 

 

La figure ci-contre montre divers types de silanes liés par covalence et utilisés avec des supports de silice.  Une  figure  illustre une polymérisation dite verticale et faisant intervenir des silanes di-et tri-fonctionnels. 

Ces phases polymériques liées sont plus stables que les phases monomériques a bas pH.  Les packings fait de cette manière peuvent cependant être plus variable dans les temps de rétention et la sélectivité que les phases monofonctionnelles.  Une autre figure  montre un autre type de silane lié à la surface, appellé polymérisation horizontale . Ces matériaux auraient une stabilité supérieur à bas et haut pH mais il y a un manque d’applications disponibles pour pouvoir se faire une opinion valablement.

  

 

 

Une large variété de packing de colonnes avec des structures  monomériques sont illustrées dans les figures ci-contre. 

Le procédé le plus utilisé est la réaction des chlorodimethylsilanes monofonctionnels avec des groupes silanols de surface.  Des silices alkyl variées et alkyl substituées sont réalisées avec cette réaction par exemple par exemple le matériau phase liée  n-octadecylsilane (ODS ou C18).  Un avantage des réactions silane monofonctionnelle est qu’elles sont reproductibles.  Un groupe silanol réagit avec une molécule de silane  produisant des structures bien définies. Ces types de packing donne souvent la meilleure efficience en raison d’un effet de diffusion rapide à l’intérieur et à l’extérieur de la mince couche de phase stationnaire.  Sont disponibles dans ce groupe, à la fois des structures protégées par des groupes dimethyl ou stériquement protégées.

De nombreux constructeurs essaient de faire réagir complètement la surface de la silice avec le silane.  En raison de l’encombrement stérique des ligands de la phase liée tous les groupes silanols de la surface ne peuvent pas réagir. Comme représenté dans la table ci-dessous

Phase liée Surface couverte (µmol/m2 % de silanols ayant réagi
Trimethyl 4,1 51
Dimethyl-3-cyanopropyl 3,6 45
Dimethyl-n-butyl 3,5 44
Dimethyl-n-octyl 3,2 40
Dimethyl-n-octadecyl 2,7 34
Triisopropyl 2,2 28
Diisopropyl-3-cyanopropyl 2,1 26
Diisopropyl-n-octyl 2,0 25
Diisobutyl-n-octadecyl 1,9 25

 lorsque la longueur de la chaîne ou l’encombrement du silane augmente le % de groupes silanols qui ont réagi diminue.  Même avec le trimethyl silane presque 50 % des groupes silanols n’ont pas réagi. Ces groupes silanols libres se trouvent en-dessous de l’ombrelle des ligands silane organiques mais sont toujours disponibles pour des intéractions électrostatiques avec des solutés appropriés. 

Certains producteurs de phase silane liées (p.e C8, C18) utilisent un procédé appellé

“Encapping” traitement de surface finale pour faire réagir complètement la surface du support de silice.  Ce procédé consiste en un traitement subséquent du packing lié avec un petit silane comme le trimethylchlorosilane, dimethylchlorosilane.  Cette approche augmente le % de la surface couverte  minimisant ainsi des réactions indésirées avec des solutés.

L’encapping ne peut surmonter complètement les désavantages d’un support acide.  Il est rapporté que ces colonnes ayant subi un traitement de surface final sont plus stables à des pH intermédiaires (pH 6 à 9) en raison d’une meilleure protection du support de silice contre la dissolution.

 

3.2.2.3.2  Rétention des phases liées en RPC

 La concentration de la phase stationnaire organique (p.e le % de carbone ) pour un packing phase liée est un guide grossier pour juger du temps de rétention que présentera une colonne particulière.  L’aire de la surface du support phase liée est un facteur majeur, au plus grande la surface spécifique au plus grand le temps de rétention (k).  Pour des séparations faisant intervenir des interactions hydrophobes uniquement, le temps de rétention augmente avec le % de carbone  aussi longtemps que les ligands organiques sont complètement accessibles au soluté.  La rétention du soluté se fait parfois par un mécanisme mixte faisant intervenir des interactions hydrophobes avec la phase stationnaire organique et des interactions phase normale avec les groupes silanols du support de silice.  Dans ce cas, le pourcentage de carbone sera moins significatif comme indicateur du temps de rétention de la colonne. 

La rétention de l’échantillon augmente pour les phases liées de plus grande longueur (C18 > C8 > C3 > C1) mais il n’y a pas beaucoup de différence entre les packings à chaînes plus longues (C8 ~ C18).  La rétention de l’échantillon peut être contrôlée dans une mesure limitée par le choix de la phase liée mais les temps de rétention change également suivant suivant la surface spécifique du packing de la colonne et le type de support de silice utilisé.

 

3.2.2.3.3 Stabilité des colonnes phase-liée

Une bonne stabilité de colonne minimise la nécessité d’ajustement ultérieur des conditions de séparation si bien les caractéristiques de la colonne devrait rester inchangée aussi longtemps que possible. Lorsque utilisées dans les mêmes conditions les phases liées alkyl à longues chaînes (C18 et C8 ) sont plus stables que les phases liées à courtes chaînes.   Une série de phase dimethylsilane modifiée sont soumises à 50°C à une série de gradient 0.1 % acide trifluoroacétique-acétonitrile (pH 2).   Les ligands à longues chaînes C18 et C8 sont clairement plus stables dans ces tests et c’est la raison pour laquelle ces phases sont préférées par les utilisateurs.  Lorsque la longueur de la chaîne diminue la stabilité de la phase stationnaire aussi diminue, le C1 trimethyl étant la moins stable.

  La stabilité et la longueur de vie d’une colonne silice phase liée est directement lié aux types de support de silice et de phases liées.  La stabilité de la colonne est fortement dépendante du pH de la phase mobile, du type de tampon et de la phase organique. 

La perte de phases liées silane résulte de l’hydrolyse de la liaison Si-O-Si qui lie le silane au support. Cette dégradation est accentuée à température lus élevée, bas pH et des phases mobiles hautement aqueuse. 

  Une autre façon d’améliorer la stabilité des phases stationnaires silanes à bas pH est d’utiliser des groupes fonctionnels stériquement protégés. Des groupes silanes monomériques volumineux peuvent minimiser l’hydrolyse d’un silane attaché par covalence au support de silice.  Chaque liaison Si-O-Si est individuellement protégée en raison de la taille des groupes isobutyls attachés à l’atome de silane Si.  L’utilisation de groupes fonctionnels stériquement protégés est bien connu en chimie des solutions et cette notion à été étendue à la surface des packings chromatographiques.  En raison de leur encombrement stérique, les groupes silanes (diisopropyl, diisobutyl ) présente une couverture de surface moins importante et présente des temps de rétention plus court que les phases conventionnelles dimethyl.

Pour ces séparations, la phase mobile est habituellement maintenue à des pH bas (pH=2) et il est souvent désirable de réaliser ces séparations à température plus élevée.

Quoique la plupart des séparations sont le mieux réalisées à bas pH , certaines séparations sont le mieux réalisées à pH plus élevé en raison du fait que

1. Les composés investigués sont instables à pH bas

2. La sélectivité n’est pas disponible à bas pH

3. Les composés protonés hydrophiles sont pauvrement retenus à bas pH.

Comme mentionné préalablement certaines colonnes de silice ne doivent pa être utilisées à des pH > 8 en raison d’une dissolution rapide du support de silice et un rétrécissement du lit de la colonne. Les groupes Si-O-Si connectant le silane au support de silice sont lentement attaqués à pH élevé.

La dégradation de colonnes de silice à des pH intermédiaire et à haut pH est minimisée en utilisant des packings de colonne ayant subi un traitement de surface finale (endcapping).

L’addition au cours du traitement finale de la colonne de petites molecules de silane au groupe silanol crée une barrière hydrophobe plus effective qui retarde la dissolution du support de silice.  

Ces résultats montrent que les groupes silanols acides exposés par dissolution de la surface de silice par la phase mobile provoquent une rétention additionnelle de ce médicament basique.  Cet effet indésirable est inhibé pour des colonnes ayant subi un traitement de surface final.

 

3.2.3  Spécifications de colonne 

 Les nécessités pour une séparation données habituellement déterminent le type et la configuration d’une colonne à utiliser (grandeur particulaire, longueur, diamètre interne etc).  Il y a plusieurs  fournisseurs possibles pour un type de colonne en particulier et ces colonnes peuvent varier grandement en performance.  C’ est pourquoi certaines informations concernant les spécifications de colonne et les performances sont nécessaires .

 

-Nombre de plateaux théoriques pour une valeur donnée de k

- Facteur d’asymétrie de pic (A)

-Valeur de sélectivité (a) pour deux solutés différents

- Contre pression de la colonne

- reproductibilité rétention (k)

-Concentration de la phase liée

-stabilité de colonne

L’information concernant ces caractéristiques devrait être obtenue du fournisseur avant achat.  Les fournisseurs en général incluent en général des informations pour les quatre premier paramètres incluant un test chromatogarphique pour chaque colonne.

Certains fournisseurs incluent des données concernant la reproductibilité de la rétention et des données concernant la concentration de la phase liée et la stabilité de la colonne sont rarement disponibles.  Certains fournisseurs garantissent leur colonne (p.e 60 jours) en ce qui concerne le niveau de performance et la durée de vie.

 

 

3.2.3.1  Nombre de Plateau

  Le nombre de plateau de la colonne (N) est une importante caractéristique de la colonne.  N défini la capacité de la colonne à produire des pics étroits pour obtenir une bonne résolution de paire de pics avec des valeurs de a faibles. 

La séparation de deux bandes dans un chromatogramme peut être modifiée en changeant les conditions expérimentales. La résolution Rs peut être exprimée en terme de trois paramètres (k, a, et N) qui sont directement liées aux conditions expérimentales.

          

                                

                                              Sélectivité    efficacité   rétention                       Equation R

 

k est le facteur de rétention, N le nombre de plateau de la colonne et a le facteur de séparation a = k2/k1 ou k1 et k2 sont les valeurs de k de deux bandes adjacentes 1 et 2

Cette équation classifie les variables expérimentales en trois catégories: rétention (k), l’efficacité de colonne (N) et la sélectivité (a).  Il est facile de regarder k,N,a, comme des variables  indépendante l’une de l’autre si bien que des changements peuvent être apportés à une variable sans affecter les deux autres mais ceci n’est qu’une approximation grossière spécialement en ce qui concerne k et a .

  Le facteur de rétention k est donné par l'équation ci-dessous ou tR est le temps de rétention de la bande et t0 est le volume mort de la colonne.   Le temps mort de la colonne est relié au volume mort de la colonne Vm (volume de phase mobile à l’intérieur de la colonne) et le débit F par l’équation ci-dessous

 

 

                           La valeur de to peut être déterminée en utilisant une estimation du volume mort de la colonne  Vm en ml, la longueur de la colonne en cm et le diamètre intérieur di en cm.

                                                                   Vm ~ 0.5Ldi2

 

 L’équation Rs suppose que le temps de rétention des deux bandes est similaire et pour des bandes chevauchantes (Rs < 1.5) ceci nécessite un nombre de plateaux typiques en HPLC (N>2000).

 Lorsque k devient petit (élution rapide), la résolution devient habituellement mauvaise.  Lorsque k est rendu plus grand, la résolution s’améliore.  Si a est augmenté, les deux bandes se séparent augmentant Rs de façon significative.  Lorsque l’efficacité N de la colonne est augmentée, les bandes deviennent plus étroites et mieux séparées  mais leur position relative dans le chromatogramme ne change pas.

 Lorsque deux bandes chevauchantes ont des temps de rétention proches de to (petit k), la meilleure approche est une augmentation de k.

Lorsque les deux bandes sont partiellement chevauchantes and tr >> to soit a ou N doit être augmentéDans cette situation il est préférable d’essayer d’augmenter la valeur de a .

Lorsque les deux bandes sont pratiquement complètement imbriquées avec tr >> to une augmentation de a est normalement nécessaire.

     Les paramètres k et a sont déterminés par les conditions définies ci-dessous qui affectent la rétention ou la  distribution de l’équilibre de l’échantillon entre la phase mobile et le packing de la colonne.

1.  Composition de la phase mobile

2. Composition de la phase stationnaire

3.  Température

 Des modifications de la phase mobile ou de la phase stationnaire va généralement affecter  la valeur de k et de a mais va avoir peut d’influence sur la valeur de N.

Le nombre de plateau N est principalement dépendant de la qualité de la colonne et peuvent être modifiés en changeant les conditions de la colonne:

1. Le débit

2. La longueur de la colonne

3. La grandeur particulaire

Une modification de ces conditions ne va pas affecter la valeur de k ou de a aussi longtemps que la phase mobile et la phase stationnaire ne sont pas changées.

     Dans le développement de la méthode, il est conseillé de changer d’abord les conditions qui optimalisent les valeurs de k et de a et puis de façon optionnelle de modifier les conditions de colonnes.

 Effet de la force du solvant

D’après l’équation de la résolution, la résolution augmente lorsque la rétention de l’échantillon k augmente.  Si deux échantillons éluent près de t0 (k~= 0) et Rs ~ =0.

La rétention de l’échantillon peut être contrôlée en variant la force du solvant de la phase mobile, un solvant fort décroissant la rétention et un solvant faible augmentant la rétention. 

L’effet de la force du solvant sur une séparation HPLC en phase inverse est illustré dans la figure 2.17 pour des injections répétées d’un échantillon contenant cinq composants et une modification de la phase mobile est opérée entre chaque injection.

Effet de la sélectivité

De nombreux échantillons seront résolus adéquatement après ajustement de la force du solvant (% B) de telle façon à obtenir des temps de rétention acceptables.  

Cependant certains échantillons peuvent présenter une séparation incomplète même si

0.5 < k < 20 pour toutes les bandes de l’échantillon.

L’étape suivante dans la méthode de développement est un modification des conditions permettant de modifier l’espacement des bandes ou ce qu’on appelle la sélectivité a

Des modifications dans a peuvent être crées par une modification de la phase mobile, dans le packing de la colonne ou dans une modification de la température.  Il est préférable de commencer par des modifications de la phase mobile.

3.2.3.2  Effet du nombre de plateau de la colonne

L’équation R indique que la résolution augmente pour toutes les bandes lorsque N est augmenté et que les valeurs de k et de a ne sont pas modifiées.  Une augmentation de N peut être réalisée en augmentant la longueur de la colonne et/ou en réduisant le débit. 

Le nombre de plateau de la colonne augmente avec différents facteurs à savoir

1.  Des colonnes bien compactées (qualité de la colonne)

2.  Une augmentation de la longueur de la colonne

3.  Des débits plus faibles mais pas trop faibles

4.  Des grandeurs particulaires de colonne plus petites

5. Une viscosité de phase mobile plus petite et une température plus élevée.

6  Moins d’échantillon

7. Effets extra colonne minima

 La performance d’une colonne peut être définie en terme de valeurs de N et d’asymétrie de bandes pour une substance test chromatographiée dans des conditions favorables.

D’une manière pratique le nombre de plateau N d’une colonne est défini par

 

 ou tr est le temps de rétention de la bande et W1/2 la largeur de la bande à demi hauteur.

 

Nombre de plateau comme fonction des conditions

Si la hauteur de plateau H = N/L est défini (L = longueur de colonne) H va varier avec la vélocité de la phase mobile lorsqu’elle passe sur la colonne (u = L/t0 ) et t0 = Vm/F

H  = A’ + B’/u  + C’u   Equation de van Deemter et al  ou A’ B’ C’ sont des constantes pour un composé particulier et un groupe de conditions expérimentales lorsque le débit varie.

Il y a un optimum de débit pour lequel H est minimum et N maximum

 

Effets d’extra colonnes

       Les précédentes discussions ignorent l’effet possible de l’équipement HPLC sur la séparation.  L’élargissement de bandes peut survenir dans différentes parties du système et contribuer à l’élargissement de bandes W:

A) dans la colonne comme discuté dans les sections précédentes (Wc)

B) dans l’injecteur ou le collecteur  (Ws)

C)  Dans les lignes et connecteurs entre la colonne et le détecteur (Wlc)

D) dans la cellule du détecteur (Wfc)

Ces contributions à la largeur de bande W observée dans le chromatogramme s’additionne de la façon suivante:

 

                      W2 = W2C + W2s + W2lc + W2fc

Aussi longtemps que les contributions de bande Ws, Wlc et Wfc sont inférieures à 1/3 W, leur effet sur W sera négligeable.

 

Effets de la grandeur de l’échantillon

  Jusqu’à présent il a été supposé que la grandeur de l’échantillon était si petit qu’il ne pouvait pas avoir d’influence sur la rétention, le nombre de plateau ou la résolution de pics individuels dans le chromatogramme.  Pour une large gamme de grandeurs d’échantillon ( p.e  < 25 µL and < 10 µg pour des colonnes de 0.4 à 0.5 cm de ID, c’est généralement le cas.  Si la longueur de la colonne ou le diamètre est réduit, le volume autorisé d’échantillon ou son poids décroit en fonction du volume de la colonne.  De façon semblable l’utilisation de colonnes plus efficientes ( N plus grand, autres facteurs les mêmes) va nécessiter des volumes d’échantillons plus petits.  La séparation de composés basiques sur des packings de colonne basée sur de la silice et en phase inverse nécessite une réduction de 10 fois ou plus de la grandeur de l’échantillon (< 1 µg) pour éviter l’élargissement excessif et le tailing et ceci comme le résultat d’interactions silanol.

    Lorsque la grandeur de l’échantillon est augmentée, les pics vont éventuellement s’élargir, le nombre de plateau N va diminuer de même que le temps de rétention.

Cette situation est appelée “saturation de colonne” ou” sample overload”.

La mesure du nombre de plateau vient d’être discutée et la table suivante donne des nombre de plateaux pour des substances neutre, de poids moléculaire environ 200 et pour des colonnes HPLC bien compactées de longueur et de grandeurs particulaires variées.

Ces valeurs sont obtenues sous des conditions optimales de viscosité faible de phase mobile et avec des débits de 0.5 à 2.0 mL/min.

La formule suivante peut être utilisée pour obtenir le nombre de plateau d’une colonne pour de petites molécules et sous des conditions optimales.

                                          ou L est le longueur de la colonne

        dp  diamètre de la particule

 

    

3.2.3.3  Asymétrie de pic

Tandis que le nombre de plateau de la colonne est une mesure utile pour sa qualité, la forme du pic est également importante dans le développement de la méthode.  Des colonnes et des conditions expérimentales qui donnent des pics symétriques sont toujours préférées. Des pics avec une mauvaise symétrie peuvent donner:

A) une mesure imprécise du nombre de plateaux et de la résolution

B) une quantification imprécise

C) résolution et bandes mineures non détectées dans la queu du pic

D) une mauvaise reproductibilité de la rétention

Une mesure pratique et utile de la forme du pic est le facteur d’asymétrie du pic As. L’asymétrie du pic ets mesurée à 10 % de la hauteur complète du pic.  De bonnes colonnes produisent des pics avec une valeur de As entre 0.95 à 1.1.

Afin de réaliser une mesure précise de la symétrie, les bandes doivent être mesurée avec une échelle amplifiée étant donné qu’elles peuvent apparaître symétrique dans un format compressé.

 

 

3.2.3.4  Quelle est la longévité d'une colonne?

 La stabilité et la durée de vie d’une colonne est dépendante de la façon dont un opérateur utilise et traite la colonne. 

Une colonne doit être remplacée lorsqu’elle ne fournit plus les performances pour une analyse particulière.  Si le nombre de plateaux diminue de 50% ou si la résolution tombe à environ ¾ de la valeur de la valeur originelle ( p.e  Rs 1.5 alors que 2 était la valeur au départ) alors une nouvelle colonne peut être nécessaire.

Une augmentation de l’asymétrie du pic As > 1.5 peut aussi être un signe que la colonne devrait être changée.  Le développement de pics avec une queue traînante peut indiquer la présence de composés fortement retenus à l’entrée de la colonne.  Ces composés peuvent être éliminés en purgeant la colonne avec un solvant fort.  Pour une colonne en phase inverse de15 x 0.46 cm par exemple, un volume de 30 ml d’un mélange de dichlorométhane /méthanol 96/4 avec 0.1% de NH4OH dans le méthanol est souvent effectif, le méthanol pouvant être utilisé pour les colonnes normales. Parfois le backflushing de la colonne avec un solvant fort peut être nécessaire.  Des colonnes de gardes sont souvent utilisées pour éviter ce genre de problème.

L’overloading de la colonne avec un échantillon peut également provoquer du tailing et cet effet indésirable peut être éliminé en réduisant la masse de l’échantillon injecté.

L’injection de l’échantillon dans un solvant qui est plus fort que la phase mobile résulte dans des bandes sortant plus tôt distordues et présentant du tailing.

Lorsque l’échantillon est peu soluble dans la phase mobile, de petit volumes dans un solvant plus fort peuvent être injectés par ex < à 25 µl pour une colonne de 0.46 cm ID. Cependant des formes de bandes moins bonnes, une précipation de l’échantillon, éventuellement un blockage de la colonne pourrait survenir.  Pour des échantillons peu solubles, une bonne solution est de le dissoudre dans un solvant fort et de le diluer avec des volumes égaux de phase mobile est une solution donnant souvent des résultats.

 

Les problèmes de frittés de colonnes :

Les problèmes de colonne les plus fréquents sont ceux associés avec des frittés bouchés à l’entrée de la colonne.  Ils peuvent être remplacés (ne pas essayer de les nettoyer) l’entrée de la colonne doit être vérifiée pour les vides qui doivent être bouchés avec précaution si nécessaire puisque aussi bien un fritté sâle et des vides peuvent affecter la forme des bandes défavorablement.

 En résumé pourquoi des colonnes peuvent-elles mourir ?

Les colonnes pour séparation en phase normale ont souvent plus stables que les colonnes utilisées pour d’autres procédés HPLC.  Certaines colonnes en phase normale (silice, cyanopropyl) ont des temps de vie de plus d’une année lorsque des échantillons propres sont utilisés.  Des résines polymères travaillant par échange d’ions ont une stabilité similaire.  Par contre des colonnes de silice en phase inverse , sont moins robuste dans un environnement aqueux requis pour ces séparations.  Mais même ce type de colonne peut être utilisée pendant des mois d’usage continu.

Des colonnes peuvent se dégrader pour plusieurs raisons:

A) les frittés ou le lit de la colonne partiellement bouché

B) Des impureté présentes dans l’échantillon et fortement adsorbées au début de la colonne

C) Des colonnes mal compactées

D) des vides formés et résulatant de shock mécanique ou thermique

E) Attaque chimique sut le support ou la phase stationnaire.

Symptômes annonciateurs de la mort d’une colonne

A) augmentation de la contre-pression de la colonne

B) des bandes présentant un “tailing”

C) perte dans le nombre de plateaux

D) perte de sélectivité

E) le facteur de rétention diminue ou augmente pour des colonnes de silice utilisée pour des composés basiques.

 

4. Préparation d’échantillons pour la  LC /MS/MS

 La nécessité de préparer l’échantillon avant des analyses biologiques et de l’environnement a longtemps été réalisée.  L’extraction liquide-liquide a une longue histoire et bien que d’autres techniques disponibles l’aient supplanté quelque peu, cette technique a toujours sa valeur.  Plus récemment, l’extraction liquide-solide ou ce qui est le plus souvent appellé l’extraction en phase solide (SPE) a pris de l’importance.

Nous nous proposons à présent de discuter les mérites relatifs des deux techniques pour la préparation d’échantillon pour l’analyse LC-MS d’échantillons biologiques et de l’environnement.

Certains chercheurs ont pu parfois mettre au point des analyses LC-MS/MS sans préparation d’échantillons et ceci est parfois possible lorsque la concentration en analyte est très élevée et que les composants de la matrice ne coéluent pas ou encore n’interfèrent pas avec l’ionisation de l’analyte. Dans une stratégie qui est fort proche, des protéines sont souvent précipitées en diluant le plasma avec un excès d’acétonitrile, centrifugation de l’échantillon et injection directe d’une portion aliquote du surnageant dans l’instrument.

     Lorsqu’une analyse est réalisée de cette manière en utilisant une colonne HPLC très courte ou pas de colonne, il y a des risques potentiels.  La suppression matricielle de l’ionisation peut poser problème sous des conditions d’ionisation en électrospray parce qu’il est connu que ce mode d’ionisation est sensible à ces effets.  C’est pourquoi, les expérimentateurs doivent utiliser des blancs matriciels de post extraction  additionnés de l’analyte et comparer ces résultats avec des standards analytiques de telle façon à démontrer que de telles effets n’interfèrent pas au niveau de l’analyse.

Un blanc matriciel est un échantillon contrôle biologique ou de l’environnement qui est connu comme étant exempt de l’analyte ciblé.

Un blanc matriciel fortifié est un échantillon contrôle qui a été additionné de l’analyte ciblé à des niveaux de concentration bien défini.

L’APCI est un mode d’ionisation en spectrométrie de masse qui est connu comme étant moins affecté par ce problème.

 

Extraction Liquide-Liquide

L’extraction liquide-liquide fait intervenir le mélange d’un solution d’échantillon aqueux avec un volume égal de solvant organique et pendant une période permettant aux deux phases liquides immiscibles d’interagir avec comme but final de faire passer l’analyte de la phase aqueuse à la phase organique.

Plusieurs facteurs peuvent peuvent affecter la récupération et la sélectivité de l’analyte à partir de solutions aqueuses, incluant la solubilité de l’analyte, le pKa, le pH de la solution et la force ionique.  Après séparation des liquides immiscibles par centrifugation, la couche organique contenant l’analyte extrait est enlevé, concentré à sec et reconstitué dans un solvant approprié pour l’analyse LC/MS (de préférence une phase mobile pour HPLC).

    Un des bénéfices de l’extraction liquide est que avec un choix judicieux de solvant et de pH, des extraits très propres peuvent être obtenus avec une bonne sélectivité pour les analytes ciblés.  Le procédé est plus difficilement automatisable et en raison du fait que dans l’industrie des centaines d’échantillons doivent être traités en une journée, l’utilisation decette technique peut amener à des goulots d’étranglement.

Par contre en raison du fait que les extraits sont relativement propres et que la sélectivité est bonne, des centaines d’échantillons extrait liquide peuvent être mesuré en LC/MS avec une bonne sensibilité et sans dégradation des performances du système.  C’est pourquoi il y aurait une nécesssité de développer une robotique pour l’extraction liquide-liquide qui soit capable de traiter un grand nombre d’échantillons.

     Le problème dans l’extraction liquide-liquide est de minimiser l’exposition des analytes à des surfaces potentiellement adsorptives.  L’exposition des analytes à des groupes silanols trouvés sur des surfaces à base de silice trouvées en SPE par exemple peut réduire la récupération de l’analyte.  Ceci ne se passe pas pendant l’extraction liquide-liquide, mais des pertes dues à l’adsorption peuvent survenir pendant l’élimination du solvant et ou l’analyte forme un résidu sec sur la surface intérieur du récipient.  Quoique non pratique, il est possible de ne pas évaporer jusqu’à sec et d’éviter ainsi le problème potentiel.

Le solvant de reconstitution final doit dissoudre l’extrait complètement et être compatible avec la phase mobile HPLC.  Lorsque toute ces conditions sont remplies, l’extraction liquide-liquide fournit d’excellent résultats.

 

Extraction en phase solide

Les racines commerciales de la SPE remontent aux années 1970.  Depuis lors, elle est devenue une technique efficace pour extraire des analytes de milieux complexes.  La SPE est capable de préparer des échantillons en parallèle (p.e 12 à 24) et utilise de faible quantité de solvants, le procédé peut être automatisé.

Quoique le bénéfice général de la SPE pour les applications LC/MS soient positives, les extraits sont souvent plutôt sâles et peuvent contenir de dines ou de petites paricules qui peuvent contribuer à l’augmentation de la pression en HPLC.

Des laboratoires signalent que l’utilisation de la SPE peut résulter en des récupérations réduites de traces d’analytes pour des composés qui sont particulièrement adsorbées sur des surfaces actives tels des médicaments basiques.

     Un exemple comparatif entre l’extraction liquide-liquide et la SPE est donné par la détermination quantitative de la réserpine dans des plasmas de chevaux.  Un analogue structurel la rescinnamine fut utilisé comme standard interne. Les extraits reconstitués furent analysés par ion spray LC-MS/MS dans le mode SRM positif. La courbe de calibration de la réserpine extraite de plasma de chevaux par extraction liquide-lquide s’est avérée linéaire de 10 à 5000 pg/mL et en utilisant la SPE , elle s’est avérée linéaire de 100 pg-5000 pg/mL.  La limite da quantification en utilisant l’extraction liquide-liquide et la SPE est de 50 pg/mL et de 200 pg/mL respectivement.

La limite de détection pour la réserpine en LC-MS/MS est de 10 pg/mL.

      Des adaptations récentes de la SPE sont apparues qui sont bien adaptées aux applications LC/MS incluant l’utilisation de la SPE à la préparation d’échantillons avec  un format de 96 puits.

 

 4. Identification des Drogues   

 La présence sur le marché de la drogue illicite d'un grand nombre de poudres, tablettes, capsules, matières végétales, liquides, pipes, cigarettes, seringues etc, est une preuve de la vitalité et de la sophistication de ce marché.  Le chimiste travaillant dans le domaine se trouve devant un problème analytique sérieux  au vu de la complexité des préparations des drogues en soi.  Habituellement elles contiennent des drogues actives d'origine et d'identité inconnue mais aussi des additifs comme du sucre, de l'amidon, de la quinine diminuant leur potentialité et leur valeur sur le marché illicite.  Lorsque l'analyste examine un échantillon, il est clair qu'il faut laisser le moins de place possible à l'erreur parce qu'elle aura des conséquences qui seront la culpabilité ou l'innocence du défendant.  Il n'y a pas de demi mesure dans l'identification d'une drogue puisque un spécimen contient une drogue spécifique ou n'en contient pas et si l'identification est positive, le chimiste doit être préparé à défendre la validité de ces résultats devant une cour de justice.  La difficulté de l'identification de drogues illicites est lié au choix des procédés analytiques qui vont assurer une identification spécifique de la drogue.  Un plan d'analyse doit généralement être présenté qui est subdivisé en deux phases.  Etant donné que la substance recherchée est une parmi probablement un millier de substances , l'analyste doit employé des tests de sélection afin de réduire les possibilités à un nombre raisonnable.  Ceci est généralement fait en soumettant l'échantillon à une série de tests de coloration qui vont produire des couleurs caractéristiques pour les drogues illicites les plus généralement rencontrées.  Même si les résultats des tests sont négatifs ils auront permis d'exclure un groupe de drogues.

Lorsque les possibilités auront ainsi été réduites, la seconde phase de l'analyse revient à confirmer l'identité de la drogue en l'arsenal des méthodes instrumentales qui sont actuellement à la disposition du monde scientifique.  Dans de nombreux cas ce seront des méthodes instrumentales comme la spectroscopie infrarouge ou la spectrométrie de masse qui seront utilisées.  Il y a différentes techniques sur lesquelles  l'analyste peut se baser pour arriver à une première approche le plus rapidement possible à savoir les tests de coloration, les tests microcristallins, la chromatographie, la spectroscopie IR et la spectrométrie de masse.  

4.1  Les Tests rapides

Les Tests de Coloration

De nombreuses drogues donnent des couleurs caractéristiques lorsqu'elles sont mises en contact avec un réactif chimique spécifique.  Ces tests donne une indication de la présence d'une drogue mais il faut insister sur le fait que ces tests ne peuvent pas être considérés comme fournissant une identification exclusive de la présence d'une drogue. Quelques réactifs utilisés sont décrits ci-dessous:

1. Réactif de Marquis  :  2% de formaldehyde dans l'acide sulfurique,  le réactif donne une coloration pourpre en présence d'héroïne , de morphine et avec la plupart des dérivés de l'opium.  Ce réactif donne également une coloration brun orange en présence d'amphétamine et de méthamphétamine.

2. Réactif de Dillie-Koppanyl : 1 % d'acétate de cobalt dans le méthanol est d'abord ajouté au matériel suspecté suivi par 5% d'isopropylamine dans le méthanol.   C'est un test de dépistage valable pour les barbituriques et la couleur est violet bleu.

3. Solution de Duquenois-Levine: La solution A est un mélange de 2% de vanilline et de 1 % d'acetaldehyde dans l'alcool ethylique, la solution B est de l'HCl concentré, la solution C est du chloroforme.  C'est un test valble pour la marijuana qui est réalisé en ajoutant les solutions A,B,C respectivement à la poudre végétale suspecte.  Un résultat positif se manifeste par une coloration pourpre dans la phase chloroformique.

4. Réactif de Van Urk : solution à 1% de p-dimethylaminobenzaldehyde et 10 % d'HCl concentré dans l'éthanol.  La coloration devient bleu pourpre en présence de LSD.  Ce test est à faire uniquement en laboratoire étant les petites quantités de LSD dans les préparations illicites.

5. Test de Scott : La solution A est une solution à 2 % de thiocyanate de cobalt dans un mélange eau-glycérine 1:1, la solution B est de l'HCl concentré, la solution C est du chloroforme.  Une poudre contenant de la cocaïne va donner une coloration bleu avec la solution A.  Lorsque la solution B est ajoutée, cette coloration bleu vire au rose clair.  Si la cocaïne est présente lors de l'addition de C, la coloration bleu est rétablie dans la phase chloroformique.

 

Les Tests Microcristallins

Une technique considérablement plus spécifique que les tests colorés est le test microcristallin.  Une goutte d'un réactif chimique est ajouté à une petite quantité de drogue sur une lamelle microscopique.  Après un certain temps une réaction chimique a lieu produisant un précipité cristallin. La grandeur et la forme des cristaux sous examen microscopique qui est hautement caractéristique de la drogue. Par exemple l'héroïne donne de très beaux cristaux en présence d'iodure mercurique.

Direct Analysis in Real Time   DART   

Récemment, la source ionique d'analyse directe en temps réel (DART) combinée avec un spectromètre de masse du type AccuTOF  peut par exemple être utilisée pour détecter des drogues sur des billets de banque.  Il n'y a pas de préparation d'échantillon ni de chromatographie qui est nécessaire.  Le billet est placé en face du DART et la présence de drogues peut être détectée immédiatement.  A tout moment une petite portion du billet est échantilonné ce qui permet d'évaluer la distribution de la drogue à la surface du billet.  La cocaïne fut trouvée en des quantités variées sur de nombreux dollars US.  La cocaïne est détectée sous la forme de son adduit protonique C17H22NO4+  (M + H)+ à m/z = 304,15488.  L'assignation de ce pic comme pic de cocaïne fut confirmée en élevant le potentiel de l'orifice de telle façon à induire des fragmentations.  L'ion fragment de cocaïne C10H10NO2+ est observé à m/z = 182,1182.  D'autres drogues furent détectée comme la procaïne , un anesthésique local qui est ajouté à la cocaïne.  Dans le cadre de la confiscation de drogues illicites de la méthamphétamine, et de l'Ectasy ont pu être détectés par ces mêmes méthodes d'analyse instrumentale. 

http: //www.jeolusa.com/ms/msprods/accutof_dart.html  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

AccuTOF™ DART™ Technology

 

Chronology

The DART ion source was developed at JEOL USA by Robert B. Cody and James A. Laramée. The first working prototype was tested on an AccuTOF time-of-flight mass spectrometer early in 2003. The first patent awarded for the DART technology soon followed (U.S. Patent #6,949,741, priority date April 2003). A commercial version of the AccuTOF DART mass spectrometer system was introduced by JEOL USA at Pittcon 2005, where it won the Editors’ Gold Award for best new product. A second DART patent was awarded in 2006 (U.S. Patent # 7,112,785).

Direct Analysis in REAL Time (DART (R)) Ion Source
Direct Analysis in REAL Time (DART™) Ion Source

DART Ion Source Operation

Reference: Anal. Chem. 2005, 77, 2297-2302

Dry gas is introduced (usually helium) and passed by a needle electrode with a potential (see figure above). A glow discharge results, which creates both charged particles and excited-state species (gaseous metastables). The gas stream then passes through an additional electrode (electrode 1) to filter out charged particles, leaving only metastables. As the stream continues through the source, it flows through a tube that can be heated. Heating the gas allows for control of both thermal desorption and pyrolysis of samples in the sample gap. Next, the stream passes through a final grid electrode (electrode 2) to prevent any positive and negative ions from recombining as they exit the source. Finally, the dry gas exits through the insulator cap. The insulator cap ensures that the operator is well protected from any of the high voltages isolated within the source. DART ionization of samples then occurs in the sample gap, which is at ground potential, room temperature and atmospheric pressure (i.e. completely ambient conditions). The ions formed are directed to the AccuTOF mass spectrometer inlet by both the gas flow and a slight vacuum on the spectrometer inlet.

 

AccuTOF™ DART™ Technology

 

DART™ Ionization Mechanisms

Since ionization occurs in the sample gap, both the dry DART gas stream and analyte are exposed to open air. Different ionization mechanisms occur depending on the type of sample being analyzed (and its concentration), the nature of the carrier gas used and the polarity of the ions formed. A brief summary of mechanisms for both positive and negative ion formation, when helium is used as the carrier gas, is given below.

Positive Ion

The metastable helium atoms formed in the source react with atmospheric water to produce ionized water clusters:

http://www.jeolusa.com/Portals/2/prodshots/AI/dart_positive_ionization.gif

The He(23S) electronic excited state has an energy of 19.8 eV and a reaction cross-section of 100Å for water ionization. The protonated water formed after reacting with the excited-state helium metastable can then react with the analyte to form a protonated molecule.

Negative Ion

Metstable helium atoms can react with a neutral (N), such as the grid electrode, or another neutral species to form electrons through Penning ionization:

http://www.jeolusa.com/Portals/2/prodshots/AI/dart_penning_ionization.gif

The electrons formed are rapidly thermalized by collisions with atmospheric gases (G) and react with gaseous oxygen to produce ionized oxygen anions. These oxygen anions can then react with sample molecules (S) to produce analyte negative ions:

http://www.jeolusa.com/Portals/2/prodshots/AI/dart_negative_ionization.gif

where: S is assumed to be a sample that contains hydrogen.

 

A Robust Open-Air Interface

http://www.jeolusa.com/Portals/2/prodshots/AI/accutof_atmospheric_press.gifThe Direct Analysis in Real Time (DART) ion source was designed and developed with the AccuTOF time-of-flight mass analyzer in mind. This high-resolution analyzer platform is the same as that used with our LC-TOF/MS system. In fact, the AccuTOF DART mass spectrometer system also comes standard with an orthogonal electrospray (ESI) source that can be quickly installed whenever your sampling needs require it.

 

 

 

 

 

 

Because DART ionization allows you to measure mass spectra from crude, undiluted samples it is especially important to have a source-to-analyzer interface designed to minimize spectrometer contamination. In the AccuTOF interface design, ions are directed to the ion guide through two off-axis orifices (Orifices 1 and 2) by both a slight potential difference and a ring lens. Because the space between the orifices is unaligned, neutral contamination is trapped before it can reach the analyzer. Thus, this design not only greatly reduces the need for routine maintenance, but also allows you to perform rapid, repeated DART analyses with no sample carryover.

 

 

4.2  Détection des drogues sujettes à abus par Chromatographie en Phase Gazeuse couplée à la spectrométrie de Masse (GCMS).

4.2.1  Introduction

La GCMS est l'une des méthodes instrumentales les plus versatiles et sensibles servant à l'identification et à la quantification de drogues sujettes à abus dans des mélanges complexes telles que l'urine, le sang et la salive.  Des nouvelles méthodes de dérivatisation de composés qui étaient non volatils, de nouvelles méthodes d'extraction, l'amélioration de la sensibilité des spectromètres de masse , de meilleurs systèmes d'acquisition de données expliquent l'usage croissant de la GCMS pour la détection de drogues sujettes à abus.

4.2.2  Les Matrices Biologiques.

La présence de drogues sujettes à abus et leurs métabolites peuvent être détectées dans des matrices biologiques comme le sang ou le plasma, l'urine, la salive, la transpiration et les cheveux représentant une grande diversité de possibilités analytiques.  Le métabolisme et les processus enzymatiques survenant en prédominance dans le foie et les reins donnant naissance à des formes conjuguées de la drogue telles des dérivés méthylés, glucurono et sulfo conjugués peuvent être considérés comme des outils supplémentaires permettant de mettre en évidence  la présence de drogues illicites dans des échantillons d'urine ou de sang.  L'une des matrices la plus souvent utilisée pour la détection de drogues sujettes à abus est le sang bien qu'elle soit l'une des matrices les plus complexes contenant des protéines, des graisses et du matériel cellulaire.  L'utilisation d'échantillon de sang pour la détection de drogues sujettes à abus présente l'avantage que des drogues peuvent y être détectés dans leur état natif avant leur métabolisation par le foie ou les reins.  Le sang total peut être centrifugé afin d'éliminer les globules rouges et en faisant attention de ne pas rompre les cellules.  Le plasma ou sérum résultant peut être soumis à analyse, le plasma différent seulement du sérum par la présence d'un facteur soluble d'anti-coagulation.  Le plasma et le sérum contiennent des taux élevés de protéines qui peuvent interférés dans certaines analyses de par la haute affinité entre nombre de protéines et des substances polaires.  Des solutions acides ou des solvants organiques sont souvent utilisés afin de précipiter les protéines.  

L'urine présente une faible teneur en protéines et lipides et en conséquence est une matrice moins complexe que le sang ou le plasma.mais la composition spécifique de l'urine peut varier toute les heures et les procédés analytiques développés ne doivent pas être influencés par ces variations.   Des problèmes d'échantillonnage liés à l'urine incluent les larges variations de concentration de drogues illicites dépendant du métabolisme, de la présence d'autres agents et du volume urinaire. Les procédés analytiques doivent être adaptés à de telles situations.  

La sueur et la salive sont des matrices relativement plus propres que le sang et l'urine en raison de taux en protéines, lipides et sucres plus faibles mais certaines drogues peuvent poser des difficultés à être mises en évidence.  La salive contient plus de 99 % d'eau de pH entre 5 et 7 et des quantités analysables de salive peuvent être obtenues par des méthodes de stimulation , par exemple en mâchonnant des substances inertes.  La concentration de drogues illicites dans la salive est plus faible que dans le sang ou l'urine et le problème est plus pointu en terme de limite de détection.  Un certain nombre de drogues illicites apparaissent à une concentration relativement élevée dans la sueur.  D'une manière générale plusieurs mL peuvent être obtenus par des exercices physiques induisant la transpiration.  Un désavantage est que la sueur peut être contaminée par exemple dans des environnements sujets à de la fumée.  Le cheveu est une matrice un peu particulière dans le sens ou la concentration de certaines drogues illicites peut varier sur la longueur du cheveu si bien que souvent l'histoire de l'usage de la drogue illicite peut être reconstituée.  L'acquisition d'échantillon de cheveux est facile et leur stockage demande un minimum de place ce qui n'est pas le cas du sang, de l'urine et de la salive qui nécessitent une réfrigération.

 

4.2.3  Préparation de l'échantillon

Une variété de méthodes de préparation de l"échantillon sont utilisées dépendant de la matrice.  Des étapes séquentielles typiques incluent l'addition d'un standard interne à l"échantillon , l'addition d'un tampon, une centrifugation si nécessaire et par après soit une extraction liquide/liquide conventionnelle (LLE), une extraction phase solide (SPE) ou une microextraction en phase solide (SPME).  Les deux dernières méthodes sont relativement nouvelles et elles assurent une pré-concentration des analytes et diminuent la quantité de solvant organique utilisé.  L'extraction SPE fait intervenir lla fixation de l'analyte sur une courte colonne ou un disque polymérique suivi par l'élution de l'analyte de la phase solide par lavage subséquent par un solvant. La microextraction en phase solide fait intervenir l'absorption de l'analyte sur de la fibre de silice modifiée, cette fibre est alors directement placée dans la porte d'injection du GC.  Les fibres SPME sont généralement placées directement dans la solution aqueuse contenant les analytes et à la fois pour la SPE et la SPME la nature du matériel polymérique influence les capacités d'extraction.  Egalement des méthodes de dérivatisation avant ou après extraction sont souvent utilisées pour améliorer les propriétés chromatographiques de l'analyte.

 

4.2.4  Procédés de Dérivatisations

Des méthodes de dérivatisations sont souvent utilisées en GCMS pour la détection de drogues illicites et pour améliorer les propriétés chromatographiques des analytes.. Les drogues illicites possèdent des groupes fonctionnels polaires comme des groupes hydroxyles,  cétones, carboxyliques et amines leur donnant un degré involatilité, les rendant instables et difficiles à séparer.  La dérivatisation des groupes polaires améliore la volatilité et la stabilité thermique de ces drogues.  Il y a trois procédés de dérivatisation communément utilisés, la silylation, l'acylation et l'alkylation.  La silylation substitue les hydrogènes actifs de groupes hydroxyles, thiols, amines par des groupes alkylsilyl donnant naissance à des silyl ethers et silyl esters.

 La réaction de silylation la plus populaire fait intervenir l'usage de N,O-bis-trimethylsilyl-trifluoroacetamide (BSTFA) en utilisant le trimethylchlorosilane comme catalyseur (TMCS). Les méthodes d'acylation remplacent les hydrogènes actifs par des groupes acyls.  Les analytes concernés sont ceux contenant des groupes hydroxy, amine, amide ou phénoliques par réaction avec des anhydrides ou des halogénures d'acyl.  Les réactions de trifluoroacetylation et de propynylation tombent dans cette catégorie.

 

 

 

 

 Des agents de dérivatisations souvent utilisés incluent le pentafluoro-1-propanol (PFP), La N-methyl-bis(trifluoroacetamide) (MBTFA) et l'anhydride heptafluorobutyrique (HFBA). 

L'alkylation est utilisée pour remplacer les hydrogénes actifs des groupes acides, hydroxy, thiols, phenols, les amines primaires et secondaires par réaction avec des halogénures d'alkyl.  

D'autres nouvelles méthodes de dérivatisation ont été développées.  L'utilisation d'alkylchloroformates comme agents de dérivatisation permet la conversion de certaines amines en carbamates et d'acides carboxyliques en esters.

 

 

4.2.5 La GC-MS de Drogues sujettes à abus

4.2.5.1  Les Opiacés 

De nombreuses méthodes de détection des opiacés exixtent et utilisent tous les types d'échantillons biologiques incluant le cheveu, la sueur et du tissu.  Les différences de concentration de l'héroïne et de ces métabolites ont été comparées d'une part dans la salive et d'autre part dans le sang et le plasma.  Après une extraction SPE de la salive, du sang et du plasma une dérivatisation avec du MBTFA des métabolites fut réalisée, l'héroïne ne nécessitant pas de dérivatisation pour une détection en GC-MS.   Une courbe de calibration fut obtenue pour la quantification acec une limite de détection de 1 ng/mL en utilisant comme méthode d'ionisation l'EI el le SIM.  Des tests de screening du cheveu et de l'urine pour la détection simultanée de drogues sujettes à abus incluant l'héroïne et ses métabolites ont été développés.  Une SPE avec une dérivatisation à la N-methyl-N-trimethylsilyl-trifluoroacetamide (MSTFA) et une dérivatisation à la MBTFA pour les métabolites de l'héroïne fut réalisée afin de détecter et d'identifier plus de 100 composés dans l'urine incluant les opiacés.   La détection du 1-a-acetylmethadol (LAAM) et de la methadone utilisés pour traiter les consommateurs d'héroïne fut réalisée en utilisant l'ionisation chimique (CI-MS) en utilisant un mélange d'ammoniaque et de méthane comme gaz   réactant.

Référence

Solana A. , Carnicero M. , Torre R. , Segura J.     J. Anal. Toxicol. , 19 (1995) 104-114

4.2.5.2  La Cocaïne

Afin de confirmer des tests de "sreening" positif de la cocaïne, la GC-MS est utilisée de façon routinière.  Des applications diverses incluent l'utilisation d'échantillons de cheveux, l'identification de différents métabolites, l'investigation du métabolisme post mortem, l'amélioration des processus d'extraction, les méthodologies de dérivatisation et l'automatisation des analyses.  

 Des tests de confirmation de la cocaïne par GC-MS incluent l'analyse de la benzoylecgonine dans l'urine mais les concentrations d'un autre métabolite l'ecgonine sont généralement plus élevées et conséquemment des techniques ont été developpées pour détecter l'ecgonine dans l'urine.  L'ecgonine et la benzoylecgonine ont été analysés par EI et SIM et les limites de détection se situent approximativement à 10 ng/mL.   Les concentrations en ecgonine furent trouvées 5 fois supérieures à celles de la benzoylecgonine pour 104 échantillons d'urine pour lesquels aucune présence de cocaïne n'avait été trouvée sur la base de l'analyse de la benzoylecgonine seule.  L'amélioration de l'analyse de la benzoylecgonine dans l'urine a été rapportée. L'impact électronique (EI) et le SIM sont utilisés en utilisant un standard interne qui est la benzoylecgonine deutérée.  Une SPE accompagné d'une estérification en une étape de la benzoylecgonine résultant en des esters propylique ou isopropylique conduisit à une limite de détection minimale de 10 ng/mL.  

L'analyse de la cocaïne et de plusieurs métabolites dans des échantillons de cheveux a été réalisée d'abord en lavant, pulvérisant et en digérant le cheveu.  Les analytes furent extraits de la matrice via des techniques d'extraction LLE ou SPE et dérivatisés en utilisant le BSTFA/TCMS comme réactif de dérivatisation .  La spectrométrie de masse fut utilisée avec ded méthodes d'ionisation classiques comme l'EI en mode SIM et des standards deutérés furent utilisés pour la quantification.

 

 

4.2.5.3  Les Amphétamines

  Une colonne capillaire  non-polaire la PTA-5 de Supelco spécialement fabriquée pour la séparation de composés aminés fut utilisée permettant des séparations sans dérivatisation.  Les ions formés en impact électronique (EI) furent détectés en mode SIM et la limite de détection observée (LOD) était en moyenne de 10 ng/mL (J. of Chromatograph. Sci.  36, 1-7 (1998). D'autres méthodes faisant usage de micro-extraction en phase solide (SPME) furent décrites par Myung et al.   ( J. Chromatograph. B.  716, 359-365 (1998).